2021 年度実施状況報告書

遺伝子改変マウスを用いたLrig1による癌幹細胞維持機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	21K08797
研究機関	大阪大学
研究代表者	牧野俊一郎大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (60745446)
研究分担者	奥崎大介大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任准教授(常勤) (00346131) 高橋秀和大阪大学, 医学系研究科, 助教 (10528508) 山本浩文大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30322184) 横山雄起大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60615714) 小泉雅彦大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90186594)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	Lrig1 / 放射線 / 癌幹細胞
研究実績の概要	+4ポジションに位置するLrig1陽性の静止期腸管上皮幹細胞は正常腸管の幹細胞性維持において重要であるとの報告は多いが、大腸癌におけるLrig1の機能はまだ不明な点が多く、また、癌幹細胞との関連性も十分には解明されていない。今回、Lrig1-GFPマウスを用いて化学発癌させたマウス大腸癌におけるLrig1 発現の意義を明らかにすることを目的とした。初年度は外科手術で切除された大腸癌組織の正常部および癌部に対してLrig1抗体を用いた免疫染色を行った。正常部では陰窩が一部染まり、癌部でも染色する症例を認め、大腸癌組織で上皮細胞にLrig1の蛋白発現が確認された。大腸癌患者186例の原発巣より抽出したmRNAを用いてLrig1発現量が予後に与える影響について検討を行った。qRT-PCRにて発現量を中央値で2群に分類し比較検討を行ったところ、全生存率OSでは差は認めなかったものの無病生存率DFSでは有意差を認め、多変量解析においても有意差を認めた。Lrig1-GFPマウスを用いた検討ではLrig1 発現の陽性コントロールとなる小脳皮質でGFPが強発現していた。このマウスにAOM (アゾキシメタン) の腹腔内投与とDSS (デキストラン硫酸ナトリウム) の飲水接種により大腸癌を作成し、腫瘍を蛍光顕微鏡で観察したところ大腸癌細胞の一部にGFP陽性細胞を確認した。さらにこのGFP陽性癌細胞をFACSで回収してLrig1mRNA発現をqRT-PCRで調べたところGFP陰性細胞と比較して有意なLrig1mRNA発現の増加を確認した。これらのGFP陽性細胞と陰性細胞をシングルセルレベルでC1遺伝子増幅器にかけてRNAシークエンスに提出した。cDNAのqualityは良質であり十分解析に耐えるレベルであった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由臨床サンプルの解析を終え、Lrig1-GFP マウスも機能していることを確認し、大腸化学発癌から腫瘍細胞のシングルセル解析までスムーズに実行できており進捗は順調であるといえる。
今後の研究の推進方策	2年目はRNAシークエンスの結果を検討するとともにin vitro実験を中心に進めてゆく。大腸癌細胞株を用いて、Lrig1発現を調べ、ノックダウンモデル、強制発現モデルを作成する。スフェアフォーメーションアッセイ、既知の癌幹細胞マーカーおよびEMTマーカーの発現解析などにより癌幹細胞性の変化を検証する。放射線や抗癌剤暴露後にLrig1発現細胞がどのような反応を示すのか検討する。Lrig1発現細胞を追跡するレインボーマウスについても準備ができており検討を進めてゆく。