| 研究課題/領域番号 |
21K08908
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
矢追 毅 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40311914)
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| 研究分担者 |
井上 匡美 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10379232)
丹藤 創 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80423870)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 肺腺がん / STAS / 空間トランスクリプトーム解析 / scRNA-seq / 腫瘍微小環境 |
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| 研究実績の概要 |
１）肺腺癌の新たな浸潤様式であるtumor spread through air space (STAS)が近年、独立予後不良因子として注目されている。病理検索・予後予測に有用なバイオマーカーの開発を端緒として、「STASの発生・進展とその背景にある癌免疫微小環境との関連性」の解明をすることが本研究の目的である。令和3・4年度において単一細胞RNA-seq法による擬似的時系列解析を使って、腫瘍構成細胞個々においてSTASの発生・進展に伴い遷移する遺伝子発現を測定し癌免疫微小環境の変化をモデル化することを目指して研究に着手した。当初計画では、患者腫瘍、近傍正常部由来の病理診断前の「新鮮無凍結」組織についてSTASの有無を自前のマーカーで確認後、各々およそ8000細胞を単離しscRNA-seqを実施することを予定していた。今年度、そのための準備を進めていたところ、トランスクリプトーム情報の取得技法について、より良い複数の選択肢が相次ぎ利用可能となる状況変化が生じ再検討を行った。
その結果、STAS細胞の存在が既に明らかなパラフィン包埋組織切片を用いて、組織中のレアなSTAS本体細胞の遺伝子発現情報をより確実に捕捉できるうえ、組織病理像との正確な対応づけが可能となる空間トランスクリプトーム解析技術の利用へと計画変更することにした。現在、この解析に必要なスライド作製方法の検討を終え、使用する病理サンプルの選定中である。データ取得後の解析方針に変更はない。
２）病理診断前の「新鮮無凍結」組織からRT-qPCR法によりSTASの有無を確認するための最終的なマーカー選定を終え、現在論文として投稿準備中である。1)の技法変更により本研究で利用の必要はなくなったが、これらマーカーからSTASの有無による腫瘍微小環境の違いに関する示唆を得ることができ、現在免疫組織化学による検証を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画で採用を予定していた、新鮮無凍結組織から単離された単一細胞群を材料とするscRNA-seqの利用から空間トランスクリプトーム解析技法への変更等に伴い、空間トランスクリプトームデータの取得に遅れが生じている。しかし、習得後のバイオインフォマティクス解析については本計画申請段階で既に準備を終えていたのに加え、空間トランスクリプトーム解析のための解析パイプラインについても令和3年度のうちに準備を整えた。
一方、STASを伴う腫瘍微小環境の違いを示す分子的基盤の報告がほぼないに等しい状況にあることに鑑みて、RT-qPCR法によりSTASの有無を確認するために最終的に選定されたマーカー遺伝子から、STASの有無による腫瘍微小環境の違いに関する示唆を得ることができた。マーカーとなるのは、STAS特異的発現変動の有意性が高い10個の遺伝子セットである。このうち組織亜型の含有比率の違いに弱い影響を受ける遺伝子は1個しかなく、これら発現量から算出されるSTAS判定スコアは組織亜型含有率の違いの影響を受けにくい。とりわけ、STASの有無によるscore差が、同じく独立予後不良因子でありながらSTASとの共起性が高い組織亜型（マイクロパピラリー）の有無から独立していたことは興味深い。これらの結果は、今後のデータ解析に一つの有用な視点を与えるものであり、本研究の目的に照らして一つの進捗として評価できる。
以上ような状況にくわえ、現在進めている病理サンプルの選定を終えれば実質１ヶ月未満で空間トランスクリプトームデータを取得でき、令和3・4年度における当初計画の内容は十分に遂行できることを考慮して、「やや遅れている」という評価を下した。
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| 今後の研究の推進方策 |
概要及び進捗状況でも述べたように、パラフィン包埋組織切片を用いた空間トランスクリプトームデータを令和4年度前半のうちには取得する。そのために、癌ステージ、年齢、性別、組織亜型含有比等なるべく揃えたSTASあり・なし各病理検体候補を早急に選定する。パラフィン包埋組織から抽出したRNAの品質が条件（断片長200塩基以上のRNA含有率が50%以上）を満たすものを最終的に選択し実施する。データ取得後は、申請計画に則り遂行していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
１）当初の計画で採用を予定していた、新鮮無凍結組織から単離された単一細胞群を材料とするscRNA-seqの利用から空間トランスクリプトーム解析技法への変更等に伴い、本研究計画の主たる支出項目である空間トランスクリプトームデータ取得実験の実施に至らなかったので次年度使用額が発生した。
２）今後の研究の推進方策欄に記したように、パラフィン包埋組織切片を用いた空間トランスクリプトームデータを令和4年度前半のうちには取得する方向で進めており、令和4年度終了時点では計画に沿った予算消化を見込んでいる。
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