| 研究課題/領域番号 |
21K08944
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
松木 悠佳 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (10464083)
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| 研究分担者 |
真木 孝尚 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (60793841)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | イオンチャネル |
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| 研究実績の概要 |
・TREK-1チャネル発現系の確立：今回用いるTREK-1は、ヒト由来のチャネルであり、大腸菌では発現しない。そのため、新たに酵母発現系を導入する必要がある。TREK1を活性化する薬物のスクリーニングに向け、本年度は酵母発現系を用いて、ヒトTREK1タンパク質の発現・精製法の構築を試みた。まず、GFP融合タンパク質としてヒトTREK1全長 (1-411 aa) を酵母に発現させたところ、細胞膜に局在したことから、ヒトTREK1は酵母内で機能体として発現すると推定した。次に、酵母を破砕し、アフィニティー精製を行ったが、TREK1の分解産物が多く十分な純度のタンパク質が得られなかった。そこで、機能ドメインを有するマウスTREK1の結晶構造を参考に、C末端側の細胞膜外領域を欠損させたヒトTREK1（1-323 aa）の発現・精製を試みた。その結果、酵母発現系より高純度のヒトTREK1 (1-323 aa) が精製できた。
・TREK-1チャネルの活性評価：精製チャネルタンパク質の活性評価は、当研究室が開発した液滴接触二重膜法（Contact Babble Bilayer法; CBB法）で行う。まず、CBB法での活性評価系の構築のためTREK1と同じK2PであるヒトTRAAKを用いている。酵母発現系より精製したヒトTRAAKを脂質二重膜に再構成し、CBB法で解析したところ、これまでの報告通り、カリウムイオン選択性を示した。またTREK1やTRAAKは、膜の張力に応答する機械受容性チャネルとして知られ、CBB法は膜張力を自在に制御できる。CBB法で、ヒトTRAAKの膜張力への応答性を解析すると、張力の変化とチャネル活性に相関関係がみられた。したがって、CBB法は精製したヒトTREK1の活性評価も可能であると推定される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度、チャネルの電流記録の測定は終わり、現在解析中である。
また、今年度、来年度予定である、ストップト・フローによるTREK-1チャネルに作用する候補薬のスクリーニングについて、現在実験を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
「TREK-1 チャネルの平面膜によるチャネル活性測定」はほぼ終了しているため、今後は鎮痛薬効果および脂質効果の検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年はコロナの影響があり、学会参加や研究会参加ができなかった。また、実験道具や消耗品が、納品されなかったため次年度に使用額が生じた。
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