| 研究課題/領域番号 |
21K09031
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
池田 崇之 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (00374942)
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| 研究分担者 |
米倉 秀人 金沢医科大学, 医学部, 教授 (80240373)
吉冨 泰央 金沢医科大学, 医学部, 講師 (80399039)
高辻 英仁 (齋藤) 金沢医科大学, 医学部, 助教 (40768959)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | sFlt-1 / 血管内皮細胞 / LPS / 敗血症 |
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| 研究実績の概要 |
敗血症患者では、血管内皮増殖因子VEGFの可溶型受容体であるsFlt-1の血中濃度が重症化に伴い上昇しているが、敗血症の進展と重症化におけるsFlt-1の役割は明らかになっていない。sFlt-1の主要産生臓器である血管内皮細胞特異的にsFlt-1をノックダウンするマウスを作成し、敗血症モデルによりsFlt-1の役割を解明する。
敗血症におけるsFlt-1の役割を直接解析するために、血管内皮細胞特異的、かつ時期特異的にsFlt-1をノックダウンできるシステムを構築した。テトラサイクリン依存的にmiRNAを発現するために、Fellmannら（Cell Rep. 2013）が構築したシステムを参考に発現ベクターを作製した。このベクターでは、テトラサイクリン依存的にGFPが発現し、その3'UTRにあるmiRNAが機能する。マウスsFlt-1安定発現Tet-on細胞にレンチウイルスによりmiRNAを発現させ、GFP発現細胞をソーティングにより選択した後、マウスsFlt-1 mRNAをqPCRにより解析した。２種類のmiRNA配列で、いずれも３割り程度まで発現が抑制されていることが確認された。タンパク質レベルを確認後、トランスジェニックマウス作成に進む予定である。
sFlt-1の産生を制御するタンパク質の同定を行った。sFlt-1産生制御配列付近のRNA配列をプローブにして、結合するタンパク質を質量分析により解析したところ、３種類のRNA結合タンパク質が候補として同定された。それぞれの遺伝子をクローニングし、初代培養ヒト微小血管内皮細胞に過剰発現させたところ、タンパク質XがsFlt-1の発現を抑制したことから、タンパク質XがsFlt-1産生制御因子の可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
sFlt-1ノックダウントランスジェニックマウスを作成するにあたり、テトラサイクリン誘導システムが確実に機能するかどうかが重要であり、in vitroの実験系でmiRNAの効果を実証するのに時間を費やしたためやや遅れる結果となった。sFlt-1産生制御機構の解明に関しては、新規制御因子タンパク質Xを同定できたことから、おおむね順調に進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）トランスジェニックマウスの作成を進めていく。トランスジェニックマウスが確立した後、テトラサイクリン依存的血管内皮細胞特異的転写活性化因子発現マウスと交配することにより、血管内皮細胞特異的sFlt-1ノックダウンマウスを作成する。また、ノックダウンマウスを作成している間に、敗血症モデルマウスの作成法と解析法を確立する。
（２）LPSによる血管内皮障害にsFlt-1が及ぼす影響を解明する。トランスウェルアッセイを用いて血管透過性へのLPSの影響とsFlt-1の作用を明らかにする予定である。
（３）sFlt-1産生制御因子の解析を進める。タンパク質XがFlt-1 pre-ｍRNAに結合すること、タンパク質XがLPSによってFlt-1 pre-mRNAへの結合が促進されること、タンパク質XがLPSによってどのように活性化されるか、タンパク質Xが他のタンパク質と相互作用するかどうかについて解析し、タンパク質XによるsFlt-1産生制御機構の全体像を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
トランスジェニックマウスの作成が遅れたことから、次年度使用額が生じた。次年度は、トランスジェニックマウス作成に加え、血管内皮細胞特異的にテトラサイクリン依存的な遺伝子発現を可能にするマウスの購入に使用する予定である。
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