研究課題
後縦靱帯骨化症(OPLL)は、脊椎椎体の後縁を連結する後縦靱帯が骨化することにより、 脊柱管狭窄を来す疾患である。 様々な要因が考えられているが、異所性骨化の要因は不明のままである。申請者は、genome-wide association study (GWAS)により同定されたOPLL発症と相関する遺伝子座に存在する疾患関連候補遺伝子Hydroxyacid oxidase 1 (HAO1)に着目し、まずHAO1の発現がin vitroの骨芽細胞分化の過程で発現が有意に低下することを見出した。そこで、HAO1の発現低下が骨化誘導にポジティブに作用すると考え、HAO1遺伝子欠損マウスを作出し、靭帯に異所性骨化が生じるか、in vivoで検証を行うこととした。HAO1は肝臓にも発現していることが知られており、全身ノックアウトでは胎生致死となり、十分にアダルトでの靱帯骨化における役割を解析できないと考え、HAO1 floxマウスを新規に作出することとした。HAO1遺伝子のexon2をloxPシークエンスで挟むコンストラクを設計し、予定通りのマウスの作出に成功し、loxPシークエンスは生殖系列にも乗って継代されることを確認した。そこで、アダルトにおいて全身的にHAO1遺伝子を欠損させるためMx1 Creマウスと交配し、Hao1コンディショナルノックアウトマウス（HAO1 cKO: Mx1 Cre/Hao1 flox/floxマウス）を樹立し、その作出に成功した。HAO1 cKOでは残念ながらOPLLの発症は認めなかったが、 尿サンプルを用いたメタボローム解析によって、驚いたことにHAO1がtricarboxylic acid (TCA) cycleの制御に関わっていることを明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
OPLLは未だ原因も骨化の進行を抑制する治療法も存在しない、いわゆる難病である。OPLLは同胞発生など、遺伝的な要因によって発症することが知られていることから、GWASは疾患発症機構を解明する上で、最も有効な手法の１つと考えられる。疾患感受性遺伝子座として同定された20p12.3は独立した2つのGWASで確認されており、HAO1はその遺伝子座に存在する唯一のopen reading frameを有する遺伝子であることから、疾患関連遺伝子候補と考えられた。同様に、GWASでは他に５つの疾患感受性のある遺伝子座を同定しており、当該SNPが存在する遺伝子座に位置し、かつopen reading frameを有する７つの遺伝子（RSPO2, EIF3E, CCDC91, EIF3H, CDC5L, RSPH9, TMEM151B）を疾患関連遺伝子候補として同定した。そこで本研究では、in vitroにおける骨芽細胞の分化培養系において、これらの疾患関連遺伝子候補の発現解析を行い、骨芽細胞の分化進行に伴い、HAO1の発現が有意に低下することを見出した一方で、他の疾患関連遺伝子候補の発現には有意な変動を認めなかった。そこで、本研究ではHAO1に着目し、またHAO1の発現低下に伴い骨芽細胞の分化が促進することから、HAO1の発現低下が靭帯骨化に有利な環境を形成すると考え、HAO1の遺伝子欠損マウスを作成し、HAO1のin vivoにおける異所性骨化抑制能を解析することとした。HAO1欠損マウスは予定通り作製に成功したが、アダルトにおけるHAO1の有意な遺伝子抑制によっても靭帯を含む異所性骨化は観察されなかった。一方で、HAO1が酵素タンパク質であり、生体においてTCA cycleを制御することを新たに明らかにした。以上の成果から、研究が概ね順調に進行している、と判断した。
HAO1については、HAO1 cKOとOPLLのモデルマウスであるttwマウスと交配することでttw/HAO1 cKOマウスを作出し、OPLL形成へのHAO1の機能の解析をさらに進める。すでにttw/HAO1 cKOマウスの作出は完了している。また、HAO1と並んで解析を予定しているビタミンDシグナルであるが、先行した解析において、ttwマウスとビタミンD受容体（VDR, vitamin D receptor）欠損マウスとの交配で作成したttw/VDR KOマウスでは、ttwマウスにみられるOPLLを含む異所性骨化が完全に消失することを見出している。このことは、ビタミンDシグナルが異所性骨化誘導において重要な役割を担うことを示唆している。しかし、どの組織あるいは臓器においてビタミンDシグナルが異所性骨化誘導に寄与しているかは明らかではない。そこで本研究では、VDR floxマウスと組織特異的Creマウス、及びttwマウスを交配し、ttwマウスにおいて、組織特異的なVDR欠損マウスを作出する。すでにVDR floxマウスと小腸特異的なvillin Creマウスは入手済みで、ttwマウスとの交配を進めており、ttw/villin Cre/VDR-flox/floxマウスの作出も完了している。今後は、解析に必要なマウス数を確保できるよう交配を進め、OPLLを含む異所性骨化に関する解析を進める予定である。
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Metabolites
巻: 12 ページ: -
10.3390/metabo12010082
