| 研究課題/領域番号 |
21K09296
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
林 正徳 信州大学, 医学部, 准教授(特定雇用) (20624703)
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| 研究分担者 |
二村 圭祐 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (00462713)
北村 陽 信州大学, 医学部附属病院, 医員 (00836033)
岩川 紘子 信州大学, 医学部附属病院, 医員 (40770772)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 腱細胞 / 筋芽細胞 / アキレス腱損傷モデル |
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| 研究実績の概要 |
令和4年度は腱幹/前駆細胞、骨髄間質細胞のフローサイトメトリーによるソーティングを引き続き行った。いずれの細胞も単離には至ったものの、Myostatinによる分化誘導アッセイの結果、腱細胞の分化マーカーの十分な発現増加が観察できなかった。一方、筋芽細胞については、Motohashi らの方法に準じてMACSを用いた採取を行い、Myostatinによる腱細胞への分化誘導アッセイを行った。しかし、本法では細胞の単離はできるものの、組織からの回収効率が悪く、十分な細胞数が確保できないこと、またその後の培養においても増殖が不十分であったことから、腱細胞への分化誘導アッセイに使用することができなかった。そこで、筋組織から採取したヘテロな細胞群から継代を繰り返すことにより、徐々に筋芽細胞を純化する方法に切り替えたところ、不完全ではあるが、実験に使用できる筋芽細胞の採取が可能となった。また、分化誘導培地を用いた筋管細胞への分化の確認もできている。現在、同細胞を用いたMyostatinによる腱細胞への分化誘導アッセイを行なっているが、細胞株では既に腱細胞への分化が確認できているため、マウス腱損傷モデルの実験には、最終的に筋芽細胞を細胞治療のソースとして用いる方向で検討している。RNAシークエンスについては、当初各細胞の性状を比較する目的で計画していたが、他の細胞を本研究で使用しなくなったことから、行わない方針とした。また、マウス腱損傷モデルについては予備実験においてSakabeらの方法に準じ作成可能であることが確認できており、また、正常滑膜内腱において、微量ではあるがMyostatinが発現していることも確認できている。現在は同モデルからのサンプルの回収法についての条件検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
マウスの腱幹/前駆細胞や骨髄幹細胞の単離やそれらの初代培養におけるMyostatinによる腱細胞への分化誘導アッセイに時間を要してしまった。また、筋芽細胞については当初MACSを用いて採取を行っていたが、本法では細胞の単離はできるものの、回収効率が悪かったため、最終的に採取法を変えたこと、さらに変更後も細胞を純化できるまでに時間がかかってしまったことが、実験が遅れてしまった主な要因である。
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| 今後の研究の推進方策 |
初代培養の筋芽細胞を用いたMyostatinによる腱細胞への分化誘導アッセイを引き続き行う。筋芽細胞は凍結保存が可能であることがわかっているが、凍結した細胞としない細胞についての腱細胞への分化能の比較検討も行う。マウス腱損傷モデルについては予備実験においてモデル作成までは終了しているため、その後のアッセイの条件検討をさらに継続しする。以上が終了したところで、マウス腱損傷モデルを①損傷のみの群、②損傷部に筋芽細胞のみを加えた群、③損傷部にMyostatinのみを加えた群、④損傷部に筋芽細胞とMyostatinを加えた群の計4群に分け比較検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和4年度に予定していたRNAシークエンスを施行しなかったことが、次年度使用額が生じた主な要因である。次年度はマウス腱損傷モデル作成とその後のアッセイ、具体的にはレーザーマイクロダイセクション、リアルタイムPCR、組織学的解析に使用する予定である。
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