| 研究課題/領域番号 |
21K09299
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
北川 教弘 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30294284)
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| 研究分担者 |
岡 千緒 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30263445)
別所 康全 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (70261253)
山下 照仁 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (90302893)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 骨代謝 / 破骨細胞 / シグナル伝達 / 免疫学 / 糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は破骨細胞分化に重要なSiglec-15-DAP12複合体を介したシグナル系と転写因子NFATc1の関連を分子レベルで解明し、１）骨吸収活性を有する破骨細胞が形成される分子機序の理解、および２）Siglec-15を標的とする治療法開発への応用に貢献することを目的としている。当該年度は下記2項目の成果を得た。
１）破骨細胞における（Siglec-15に結合するDAP12）/（全DAP12量）の算出を試みた。RAW264細胞からin vitroで分化誘導した破骨細胞から細胞抽出液を作成し、抗Siglec-15抗体でimmunodepletionを行った。免疫沈降前後の上精を抗Siglec-15抗体でウェスタンブロットした結果、Siglec-15量は免疫沈降前と比較して16%まで減少していたのに対し、DAP12は86%に減少が止まった。同時に対照抗体ではSiglec-15、DAP12ともに免疫沈降前後でほぼ変わらなかった。このことは破骨細胞で発現するDAP12の大部分がSiglec-15と会合していないことを示唆する。
２）多発性骨嚢胞と白質脳症による認知症を呈する那須・ハコラ病は劣性遺伝疾患であり、DAP12はその原因遺伝子の一つとして見出されている。またDAP12 遺伝子欠損マウスは視床領域でオリゴデンドロサイトの成熟に障害を原因とする髄鞘形成不全を呈することが報告されている。そこで13週齢Siglec-15遺伝子欠損マウスの視床領域切片を作成し、抗ミエリン結合タンパク質抗体にて免疫染色した。その結果Siglec-15遺伝子欠損マウスの染色像は野生型と差が認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
近年Siglec-15は骨疾患のみならずがん免疫療法の標的分子として捉えられている。DAP12はSiglec-15以外にも複数種の受容体と複合体を形成することから視床領域のオリゴデンドロサイトではTREM2などの別種の受容体が働いている可能性は高いが、Siglec-15が働く可能性を排除できない。Siglec-15遺伝子欠損マウスで髄鞘形成不全がないことが明らかになった場合、Siglec-15を標的とした治療法が脳への影響がないと推定しうるため本実験の波及効果は大きい。概要２）の結果はこれを支持するものではあるが、同時に行ったDAP12遺伝子欠損マウスの視床領域切片の免疫染色でも、既報から計画当初に予期していた髄鞘形成不全が認められなかった。そこで概要２）の結果ではSiglec-15遺伝子欠損マウスで髄鞘形成不全がないと結論づけるには不十分である。そこで１）視床以外の脳領域、２）切片作成に用いるマウス週齢、３）、免疫染色によるSiglec-15発現細胞の同定、４）抗ミエリン結合タンパク質抗体による免疫染色法の条件検討、についてさらに検討を続けている。
上記に飼育中マウスを用いた結果、in vitroの解析に利用するマウス数が減少し、in vitro実験系を用いた実験のいくつかは計画の変更もしくは遅延を余儀なくされた。研究計画調書A-3では「破骨細胞分化の各分化段階において、DAP12と複合体を形成するDAP12会合受容体の存在比を明らかにする」ことを計画していたが、「破骨細胞における（Siglec-15に結合するDAP12）/（全DAP12量）の算出」に限局して研究を行い、概要１）に示す成果を得た。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は「成熟破骨細胞形成において、DAP12を介したITAMシグナル経路はどのような分子メカニズムにより制御されるのか？」を研究課題の核心をなす学術的問いとしている。本年度は研究計画調書で提案した実験計画の未だ実施していない項目について研究を進めていく。これまでの本研究にてSiglec-15が必要かつ十分なDAP12会合受容体であることを強く示唆する成果をあげていることから、特に以下の3点を重点的に解決していく。
１）revSSDKAの発現がDAP12KOマウスの大理石骨病を回復するのかをa. 骨形態計測（外部機関へ発注）、b. 血清から骨吸収および骨形成の生化学的マーカーの測定、の2点について評価を行う。これまで得られているμCT解析の結果と合わせて研究結果を考察する。
２）進捗状況で記載した通り、Siglec-15遺伝子欠損マウスの脳組織を野生型マウスおよびDAP12遺伝子欠損マウスと比較する。
３）revSSDKAをSiglec-15 /DAP12両遺伝子欠損マウスに発現させ、アフィニティー精製と質量分析法により会合するタンパク質を単離・同定する。当初の計画ではV-setドメインに結合するタンパク質を探索することを計画していたが、ITAM中のチロシン残基リン酸化依存的に結合するタンパク質にも着目する。これはa. Sykなどがリン酸化依存的に結合するタンパク質として同定されているため、実験系の妥当性を検証できること、b. 新規のシグナル分子が同定される可能性があること、の2点が理由として挙げられる。見出した候補分子について、それらをコードする遺伝子をゲノム編集法で破壊し骨吸収活性を有する破骨細胞形成における役割を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由）Siglec-15遺伝子欠損マウスの視床領域における髄鞘形成について重点的に研究したため、破骨細胞特異的にrevSSDKAを発現するトランスジェニックマウスの使用頭数が減少し飼育費用が予定を下回った。また培養細胞を用いた実験は最小限度にとどめたことから、細胞培養や分子生物学的実験に係る費用が想定よりも掛からなかった。以上のことから結果として次年度使用額が発生した。
計画）研究計画自体に大幅な見直しはなく、計画当初に予定した実験計画を遂行する予定である。まず必要な遺伝子型マウスの作出のため、マウス飼育に係る費用に使用するとともに、得られたマウス骨の骨形態計測を外部機関へ依頼する費用に充てる。またタンパク質のアフィニティー精製や、抗体などの消耗品の購入や質量分析（学内サービスの利用）に使用する。これまでの研究ならびに本年度得られるであろう研究成果を論文として国際誌に発表するため、英語論文の校閲費ならびに投稿費用へ次年度経費と本年度経費を使用する。
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