| 研究課題/領域番号 |
21K09309
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
依田 昌樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (30464994)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 筋再生 / 筋線維化 / FAPs / 加齢 / 筋損傷 / 筋拘縮 |
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| 研究実績の概要 |
筋損傷・筋拘縮・加齢は、骨格筋の再生能力を低下させるばかりではなく筋変性を生じる。病的環境下などの恒常性維持機構が低下している状態において、筋組織は筋線維化および脂肪浸潤といった変性を呈することが言われている。この一端を担っているのが筋組織中に存在する間葉系前駆細胞（FAPs; Fibro-Adipogenic Progenitors）であり、FAPsが線維芽細胞および脂肪細胞へと異常分化が原因と言われている。本研究では、筋損傷モデル、筋拘縮モデルマウスを使用しFAPsの動態を明らかにし異常分化の原因を解明することを目的としている。
一般的に筋損傷が起きると筋再生のために「足場」と考えられる細胞外基質が多く組織中に観察される。本研究では前脛骨筋（TA）を用いて筋損傷を起こし経時的に遺伝子発現を測定した。その結果、コラーゲンIII、Ctgf、Tnc、Tgfbといった線維化に関与している遺伝子発現が損傷1日後から筋組織中で有意に上昇していることが示され、再現性も確認できた。また、FAPsを赤色蛍光で可視化できるマウスを用いて損傷3日後および7日後の免疫染色を行った結果から、間質組織中のFAPsの増加およびコラーゲンIIIの増加が確認できた。さらに、FACS解析も行い筋損傷後のFAPsの数の継時的変化および細胞表面抗原の変化なども解析を行った。さらに、筋損傷後および筋拘縮後に単離したFAPsからRNAを精製し、RNA-seq解析を現在行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2022年度は凍結胚から復元した個体から交配を始める作業から行ったため、マウスを実験に使用した時期が7月下旬からとなった。その間は採取・保管しておいた組織切片およびcDNAを使用し解析を行った。組織の線維化に関連していると言われているTGF-bの遺伝子発現も筋再生中に一時上昇することが示され、コラーゲンIII発現に寄与していることが示唆された。またマウス飼育の再開後、筋損傷をおこした前脛骨筋組織から細胞を単離しFACS解析をおこなった。FACS解析の結果からFAPsの頻度および前脛骨筋組織中の細胞数を解析したところ、筋損傷3日後においてコントロール群と比較し有意にFAPs数が上昇していた。
また、これまでの遺伝子発現の結果は前脛骨筋組織全体から得られたデータなのでFAPsの関与を説明するためには損傷後のFAPsを単離し解析する必要性が考えられた。2022年度後半からは筋損傷後のFAPsの単離をセルソーターで行いRNA精製を試みた。当初、採取できるFAPs数が少なく従来法では解析に十分なRNAが採取できなかったが、検討を重ね解析に耐えうるレベルのRNA採取が可能となった。現在、外部委託にてRNA-seq解析を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
2023年度は、まず筋損傷および筋拘縮モデルから得られたFAPsのRNA-seq解析を中心に行い、筋組織の線維化を中心とした筋変性に関連していると想定される遺伝子群を専用ソフトを用いて選定する作業から始める予定である。また、筋損傷モデルに関しては老齢マウスの筋損傷後のFAPsのRNA-seq解析を追加し、加齢に伴う遺伝子変動を精査する予定である。遺伝子選定後はパスウェイ解析ソフトを使用し関連分子のシグナル伝達系を解析予定である。シグナル伝達系の解析から得られた結果から、筋損傷および筋拘縮における筋変性が阻害剤および中和抗体により改善するのかを検討する予定である。
並行して、遅れていたin vitro系の立ち上げを目指し、若齢および老齢のFAPsが筋分化に影響を与えるのかを、共培養実験から検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2022年度はマウス室の改修工事終了に伴い、凍結胚からの外部機関（実験動物中央研究所）での個体復元のために資金を使用予定であったが、実経費として個体復元費および飼育費が予想よりも安価であったため当初予定していた経費の余剰分が生じた。また、RNA-seq解析を外部委託で行うための費用が依頼時期とキャンペーン時期が重なったため、余剰分が生じた。2023年度は余剰分の経費を復元したマウス飼育費およびRNA-seq解析の追加分にあてる予定である。また、今年度分の資金とあわせて遺伝子解析用試薬・細胞単離用のFACS用試薬・免疫染色用抗体などの消耗費にあてるほか、コロナ禍で控えていた学会にも参加を行う予定であり学会参加費に使用予定である。
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