| 研究課題/領域番号 |
21K09710
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
梶田 敬介 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 客員研究員 (10896765)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | 網膜色素変性 / EYS / 網膜色素上皮 |
|---|
| 研究実績の概要 |
EYS(eyes shut homolog)は日本人における網膜色素変性(RP)の約3割を占める重要な原因遺伝子だが、その機能に関する研究は驚くほど少なくRP病態におけるEYSの役割は明らかではない。これまでの研究ではEYSは視細胞内に局在し、外節構造の維持に関与すると考えられていた。しかし、EYSは視細胞外に分泌され、網膜色素上皮(RPE)に発現し貪食能を制御するPROM1と相互作用する可能性が示された。本研究では「分泌されたEYSはRPEに発現するPROM1と相互作用することで、RPEの貪食能を制御しているのではないか」という仮説を立て、これを実証することを目的とする。
上記の仮説を実証するため、以下の２つの課題を実施する。
「課題１．光刺激時におけるEYSとPROM1の局在解析」明順応・暗順応させたゼブラフィッシュの眼組織およびブタ網膜組織の切片を作成し、抗EYS抗体と抗PROM1抗体を用いて免疫組織染色を行う。これによりEYSの局在が明順応・暗順応で変化していること、RPE周辺でのPROM1と共局在していることを明らかにする。また、光刺激時におけるEYSの局在変化が種族間で共通であるか検討する。
「課題２．EYS存在下でのRPE貪食能変化の検討」RPE細胞を分泌EYSと共培養し、貪食能を評価する。これにより、培養液中に分泌されたEYSがRPEの貪食能に与える影響を明らかにする。 FLAGペプチドが融合したEYSを発現するプラスミドは既に作成に取りかかっており、EYS遺伝子のクローニングは完了している。実験にはLonza社human RPE細胞と、iPS細胞 (253G1) から分化させたRPE細胞を用いる。貪食能の評価については、蛍光ラベルしたブタ網膜外節を独自に作成しており、RPEに貪食させた後に撮影した画像の蛍光強度を測定することで、RPEの貪食能を評価する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
課題１．光刺激時におけるEYSとPROM1の局在解析
1年度には、ゼブラフィッシュの眼組織およびブタ網膜組織の切片を作成し、抗EYS抗体と抗PROM1抗体を用いて免疫組織染色を行う。この実験により、ゼブラフィッシュとブタで抗EYS抗体と抗PROM1抗体で既報と同様のシグナルが確認できることを確認する予定であった。ゼブラフィッシュと豚網膜組織の切片を作成し、抗EYS抗体を用いて免疫染色を行いEYSの発現を確認した。引き続き抗PROM1抗体を用いて共発現を確認する。
課題２．EYS存在下でのRPE貪食能変化の検討
RPE細胞を分泌EYSと共培養し、貪食能を評価する。これにより、培養液中に分泌されたEYSがRPEの貪食能に与える影響を明らかにする。 1年度には、FLAGペプチドが融合したEYSを発現するプラスミドを作成する。 プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクションし、抗FLAG抗体を用いてウエスタンブロットまたはドットブロットを行う。培養上清のウエスタンブロットを行うことで、トランスフェクション方法・プラスミドの濃度・培養細胞数を最適化する。また、細胞内および培養液中のEYS発現を確認する。上記プラスミドは作成でき、HEK293T細胞にトランスフェクションを行いEYSの過剰発現を確認できた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
課題１．光刺激時におけるEYSとPROM1の局在解析
2年度には、明順応・暗順応させたゼブラフィッシュの眼組織およびブタ網膜組織の切片を作成し、抗EYS抗体と抗PROM1抗体を用いて免疫組織染色を行う。これによりEYSの局在が明順応・暗順応で変化していること、RPE周辺でのPROM1と共局在していることを明らかにする。また、光刺激時におけるEYSの局在変化が種族間で共通であるか検討する。
課題２．EYS存在下でのRPE貪食能変化の検討
2年度以降では、EYSが分泌された培養液をRPE細胞に添加し、RPE細胞の貪食能変化を評価する。貪食能の評価については、蛍光ラベルしたブタ網膜外節を独自に作成しており、RPEに貪食させた後に撮影した画像を解析することで、RPEの貪食能を評価する。またフローサイトメトリーを用いて、蛍光ラベルしたブタ網膜外節を貪食したRPE細胞数を測定する。の変化により評価する。実験にはLonza社human RPE細胞と、iPS細胞 (253G1) から分化させたRPE細胞を用いる。RPE細胞を分泌EYSと共培養し、貪食能を評価する。これにより、培養液中に分泌されたEYSがRPEの貪食能に与える影響を明らかにする。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
課題１．光刺激時におけるEYSとPROM1の局在解析
2年度には、明順応・暗順応させたゼブラフィッシュの眼組織およびブタ網膜組織の切片を作成し、抗EYS抗体と抗PROM1抗体を用いて免疫組織染色を行う。これによりEYSの局在が明順応・暗順応で変化していること、RPE周辺でのPROM1と共局在していることを明らかにする。また、光刺激時におけるEYSの局在変化が種族間で共通であるか検討する。
課題２．EYS存在下でのRPE貪食能変化の検討
2年度以降では、EYSが分泌された培養液をRPE細胞に添加し、RPE細胞の貪食能変化を評価する。貪食能の評価については、蛍光ラベルしたブタ網膜外節を独自に作成しており、RPEに貪食させた後に撮影した画像を解析することで、RPEの貪食能を評価する。またフローサイトメトリーを用いて、蛍光ラベルしたブタ網膜外節を貪食したRPE細胞数を測定する。の変化により評価する。実験にはLonza社human RPE細胞と、iPS細胞 (253G1) から分化させたRPE細胞を用いる。RPE細胞を分泌EYSと共培養し、貪食能を評価する。これにより、培養液中に分泌されたEYSがRPEの貪食能に与える影響を明らかにする。
|
