| 研究課題/領域番号 |
21K09741
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
松下 賢治 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (40437405)
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| 研究分担者 |
臼井 審一 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (20546882)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 緑内障 / 神経保護 / 高眼圧 / アストロサイト |
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| 研究実績の概要 |
緑内障は眼圧というメカニカルストレスに対する視神経乳頭の応答ととらえることができ、近年そのストレス応答の一つとして視神経乳頭における活性化アストロサイトの初期反応が重要であるとされている。その観察に向け開発した乳頭アストロサイトのメカニカルストレスに対する応答を検討する培養系で我々は緑内障発症極初期に活性化とは異なるアストロサイト応答、すなわち遷移状態（Preconditioning state）の存在を発見し、生体での再現性を証明した。本年度は、Preconditioning stateが生じた後の網膜変化をGFAP、S100b、Brn3aの蛍光染色（切片及びwholemountアッセイ）で解析した。さらに、FluorogoldによるRetrograde tracing 法を開発し、網膜神経節細胞死の経過を観察した。興味深いことに、Preconditioning stateは高眼圧眼だけでなくその反対眼にも生じることを見出した。すなわち、両眼の間にアストロサイト応答を連鎖する媒体（細胞ないしサイトカイン等）の存在が示唆された。次いで、多光子顕微鏡による眼底観察を試み、造影モデルでの４D観察に成功した。更にそのメカニズムを観察するためレポーターマウスを作成している。本年度は、GlastCRE_ERT2マウスとBrainbowマウスを導入し、掛け合わせによりGlastCRE_ERT2XBrainbowマウスを作成した。これは、Glastを発現する網膜内グリア細胞（特にミューラー細胞）をタモキシフェン処理により４色のレポータ遺伝子の発現により発色させる方法で、細胞系譜や形態変化の観察に適している。我々は、このレポータマウスの発色を確認し、その発色効率を解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
乳頭アストロサイトのメカニカルストレスに対する応答における遷移状態（Preconditioning state）が起こる機序と制御について解析するため、生体観察系の確立と時期の特定が重要である。観察系としてレポーターマウス作成に成功し、発色の確認と３Dイメージングに成功した。更に、多光子顕微鏡による眼底観察を試み、造影モデルでの４D観察に成功している。多光子顕微鏡による生体観察は、特に眼球に置いて光毒性や光障害を考慮すると短時間観察しか現時点では使用できない。蛍光染色法によって決定的時期を特定していく必要があり、その情報を確認しつつある。本年度は計画通りの成果を上げている。
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| 今後の研究の推進方策 |
蛍光染色で特定した時期のPreconditioning stateの発祥を多光子顕微鏡でモニターする。この形態変化には、あるカルシウム結合タンパク質（S100）が関与している可能性があり、メカニカルストレス下で分泌増強される可能性を検討する。この物質は網膜内でも発現は確認されており、先行して行った公開データに基づく、Single cell data sub 解析でも支持されているので、まずqPCRを用いたRNA解析を行う。網膜硝子体内の分子変化を捉えるため、負荷後の生体サンプルを抽出し、同様にRNA解析し、さらに、公開されている負荷サンプルによるSingle cell dataをサブ解析から、形態変化関連分子を特定し、その機序を解明する。
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