| 研究課題/領域番号 |
21K09769
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
亀田 健治 愛媛大学, 医学系研究科, 研究員 (60363264)
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| 研究分担者 |
村上 正基 愛媛大学, 医学系研究科, 特任教授 (20278302)
森 秀樹 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (60325389)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 三次元培養皮膚 / エクリン汗腺 / 再生医療 |
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| 研究実績の概要 |
皮膚再生医療を推進する目的のために、よりヒトに近い機能性三次元培養皮膚の作製は悲願である。我々はこれまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することで、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立し報告した。培養皮膚の作製法はここ数年である程度の確立を認め、熱傷などに対する保険適応治療として、ベンチャー企業などからも患者角化細胞を用いた培養表皮が供給されるようになり、これによる自家移植が可能となった。しかしながら機能面からみた場合、これら培養表皮は自家移植された植皮片には及ばない。今後マウスモデルに代わる実験モデルを目指す上で、三次元培養皮膚内で表皮及び真皮内に付属器を再現することのみならず、機能的な汗腺構造の再構築を可能とすることは、非常に重要な課題である。これまでの検討結果をさらに進化させ、三次元培養皮膚内で、機能性エクリン汗腺導管・腺房構造の構築を目指すことを主目的とする。
本研究の目的は、現在までに改良されてきた皮膚三次元培養表皮をさらに進化させ、機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養皮膚の新規作成法を確立し、臨床応用を目指すことである。現在、ベンチャー企業などから供給される自家培養表皮には機能性エクリン腺あるいは毛包などは含まれていない。現時点では欠損部を被覆するための組織片の位置づけとなる自家培養表皮シートであるが、我々は、さらにエクリン汗腺の機能を有する次世代型の表皮シートあるいは自家培養皮膚の開発を目指す点において独自性・独創性がある。今回我々は、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる次世代型の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すが、その結果を国内国外へ発信することで、あらたな基礎研究のプラットホームとして機能することのみならず、多数の皮膚疾患患者に対する臨床応用へ発展されていくことを強く切望する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
多指症患者様から得られた指尖部より、エクリン汗腺のorgan cultureを行った。すなわち、label retaining法及び免疫染色にて維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養し、含有される幹細胞の同定・単離を行った。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、培養した。
表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして、表皮幹細胞マーカーMelanoma- associated chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)陽性細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングにて同定・回収している。
しかし、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4のマーカーでのソーティング条件がまだ安定していない。今後、三次元構造形成及び分化について３Dイメージングを用いて確認をし、最適条件を探索したい。
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| 今後の研究の推進方策 |
TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4のマーカーでのソーティング条件がまだ安定していない。
多指症患者から得られた指尖部より、エクリン汗腺のorgan cultureを行っているが、維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養の最適条件を探索する。また、含有される幹細胞の同定・単離をlabel retaining法及び免疫染色にて行う。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、全経過として約1ヶ月以上を要する。表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして、表皮幹細胞マーカーMelanoma- associated chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)陽性細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングにて同定・回収する。
その後、発育させた未熟なエクリン汗腺細胞から組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行う。機能マーカー(各種ケラチン(K5, K14, K1, K10等)、involucrin, loricrin, TGase1等) を免疫染色し、三次元構造形成及び分化について３Dイメージングを用いて確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングして解析し,Organ cultureにて得られた汗管細胞・腺房細胞を其々分化誘導培地にてさらに培養を行った。角化細胞誘導培地に変更後、上皮系マーカー(ケラチンK5, K14, K1, K10等など)、汗腺系マーカー(CEA、GDCFP-15など)を免疫染色することにより増殖した細胞の性質を確認したが、今のところ安定したデーターが取れてい ないため、何度かの追試が必要となったため。
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