| 研究課題/領域番号 |
21K09792
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
金輪 真佐美 (福永真佐美) 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 助教 (00284208)
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| 研究分担者 |
藤本 勝巳 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (40294566)
平田 伊佐雄 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (40346507)
中島 歩 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40448262)
河本 健 広島大学, 学術・社会連携室, 特任教授 (50224861)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 間葉系幹細胞 / 脂肪由来MSC / DNAマイクロアレイ / 線維芽細胞 / 遺伝子発現 / DEG |
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| 研究実績の概要 |
間葉系幹細胞 (MSC)は様々な組織から分離、培養することができる細胞であり、骨、軟骨、脂肪などへの多分化能を有している。MSCは、最初は骨髄より分離され、再生医療に応用されていたが、近年、脂肪組織由来MSC (ASC)も臨床応用されている。我々は過去に多数株の骨髄由来間葉系幹細胞（BMMSC）の分化能を分析したところ、株によって分化方向や分化能に高低差があり一定でないことを報告した。分化能に個人差のあるMSCを利用し臨床応用する場合、分化能の予知ができるマーカーが必要である。そこで、我々はBMMSCの分化能を予知する手段として分化前に発現している遺伝子に着目した。そして分化前のBMMSCに発現している多数の遺伝子の中から線維芽細胞（FB）の発現レベルより高い遺伝子を予めDNAマイクロアレイによって選定し候補遺伝子とした。候補遺伝子についてリアルタイムPCRによって両細胞の発現レベルを詳細に分析した。それらの遺伝子の中からBMMSCの分化能の予知マーカーを同定した。
本研究においてもBMMSCの予知マーカーを同定したようにまず候補遺伝子を選定するために未分化なASCとFBに発現している遺伝子の違いを分析した。前年度までに、Gene Expression Omnibus databaseから3 typeのstudy のDNAマイクロアレイデータを入手し３倍を基準として発現変動遺伝子 (DEGs, Differentially Expressed Genes)を分析した。FBよりもASCで３倍以上の発現差がある遺伝子は17個しか確認できなかった。より多くの候補遺伝子を選定するために発現差を1.5倍としたところ、DEGsを123個同定することができた。123個のDEGsの機能解析を行うと細胞外基質を構成する遺伝子が多く含まれていることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
幹細胞の遺伝子発現データは培地の種類などの培養条件によって変動する。また線維芽細胞の遺伝子発現も分離する組織によって特徴があり、同じではない。さらにDNAマイクロアレイの種類によって搭載されている遺伝子の種類も同じではない。これらのことより、予知マーカー遺伝子を絞り込むための候補遺伝子の同定は困難であると予想していたが、FBよりASCで1.5倍以上の発現差のある遺伝子が123個同定できたのでおおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
脂肪由来MSC（ASC）と線維芽細胞（FB）は形態、表面抗原等非常によく似ているので両者を区別することは難しい。本研究では両者を区別する手段として遺伝子発現に焦点をあててきたが、今後は遺伝子間の関連性について検討し、ネットワークの中心となる遺伝子群ならびにhub遺伝子があるかについて確認する。具体的にはまず123個のDEGのPPIネットワークを構築する。遺伝子間のネットワークを分析するツールであるSTRING を用いてa confidence score > 0.4 (default condition)の条件で分析しCytoscape softwareによってネットワークを可視化する。PPIネットワーク中にmoduleが構成されているかについてCytoscape にMolecular Complex Detection (MCODE)のプラグをインストールし分析する。また、PPIネットワーク中のHub遺伝子はCytoscape にCytoHubbaのプラグをインストールしMCCスコアを分析することによって同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究は脂肪由来MSC（ASC）の分化予知マーカー遺伝子を同定するための第一段階として、多数検体から得られた幹細胞のＲＮＡを抽出し脂肪由来MSCの分化前の遺伝子発現についてＤＮＡマイクロアレイの実験を行い、候補遺伝子を同定する予定であった。しかし、幹細胞の遺伝子発現は培養条件に影響され、幹細胞の培養条件は研究室毎に異なる。本研究の培養条件のみで得られた結果が他の研究室でも同じ結果が得られる可能性は高くない。そこでまず、異なった培養条件でも共通して発現している遺伝子を同定するために培養条件は異なるものの、既に公開されているDNAマイクロアレイデータの中でASCの未分化時の遺伝子発現データを検索し、ダウンロードし分析した。そのため当初予定していたDNAマイクロアレイ実験を行わなかったので未使用分として繰り越されている。24年度以降に培養関連の経費、受託解析、解析ソフト料、学会発表等に使用する予定である。
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