| 研究課題/領域番号 |
21K09803
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
林 礼人 順天堂大学, 医学部, 客員教授 (10365645)
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| 研究分担者 |
野尻 岳 順天堂大学, 医学部, 助手 (20837231)
市原 理司 順天堂大学, 医学部, 准教授 (40599247)
内山 美津希 順天堂大学, 医学部, 助手 (60814506) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 端側神経縫合法 / 人工神経 / 無細胞化神経 / シュワン細胞充填 / 軸索再生 |
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| 研究実績の概要 |
われわれは,ラット20mm坐骨神経欠損に対してSchwann細胞（以下:SC）を遊走させた人工神経が、通常の人工神経と比較して、どの程度優れているかを検討した。
10～14週齢Sprague-Dawleyラットの坐骨神経を用いて実験を行った。モデルは2群作製し、端側神経縫合法を用いてドナー神経のSCを人工神経管内に遊走させた群をシュワン細胞充填型人工神経群（SCiAN）とし、通常の人工神経を移植した群をAN群と定義した。SCiAN群は、初回手術で坐骨神経両端に上膜開創と部分軸索断裂を加え、端側神経縫合法を用いて全長22mm人工神経を上膜開創部に縫合し4週間SCを遊走させた。2回目の手術で、SCが遊走した人工神経を採取し、別ラット坐骨神経20mm欠損に移植し,端端神経縫合を行った。AN群は、20mmの通常人工神経をラット坐骨神経20mm欠損部に架橋し端端縫合を行った。評価項目は4週のSC面積率、16週の軸索面積率、軸索数、形態学的評価を行い、16週時点での機能評価について検討した。組織評価部位は、人工神経近位断端（AN-P）、人工神経遠位断端（AN-D）、坐骨神経遠位断端（Scia-D）で評価を行った。4週のシュワン細胞面積率は,SCiAN群の方がAN群よりも高かった。16週の軸索数評価はAN-Dの地点で行い、SCiAN群82.79個,AN群12.22個であった。この様に4週のSC充填率、16週の軸索再生ともにSCiAN群の方で良好な神経再生を得ていた。機能評価は、16週時点の足底感覚と筋再生を評価した。Von Frey filament testでの疼痛逃避反応は,AN群23g,SCiAN群64gであり,SCiAN群で有意な感覚の改善を認めた。筋再生は16週時点の筋横断面積に2群間で有意差を認めなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
16週の経過では、機能評価として感覚神経のみの改善しか得られなかったため、もう少し長期（24週）のモデルを作成し、軸索伸長と、運動神経の改善が得られるかについて検討を行った。
軸索面積率、軸索数、形態学的評価の評価部位は、人工神経遠位断端（AN-D）と坐骨神経遠位断端（Scia-D）の部位で評価した。24週におけるAN群の坐骨神経面積率は、SCiAN群の坐骨神経面積率の1/2程度であった。24週におけるAN群の軸索数は、（AND: 41.64 個, SD: 10.11 個）であり、SCiAN群の坐骨神経面積率は、（AND: 85.53 個, SD: 58.18 個）であった。軸索長はAN群よりSCiAN群の方が長かった。機能評価としては、前脛骨筋の筋横断面積中央部の関心領域の平均値を算出したが、AN群では、SCiAN群の1/3程度であった。
16週の経過と同様に24週の経過においてもSCiAN群で軸索面積率、軸索数、形態学的評価が有意に優れている結果であった。また、16週の時点では改善を認めなかった運動神経はSCiAN群で改善傾向であったことから、長期の経過では、ラット坐骨神経20mm欠損という巨大神経欠損においても神経再生が得られることが分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
①端側神経縫合法を用いて人工神経内にシュワン細胞を誘導する期間は先行研究より4週が最適であるとの結果であったが、人工神経においては、長期間体内に留置すると分解してしまうという生体特性を持っていることからより短い期間でもシュワン細胞を人工神経内に遊走可能なのかについての評価を行う。
具体的には、免疫染色の縦断面によるシュワン細胞量の評価と、定量PCRにおける炎症細胞（マクロファージ｛CD68,CD163｝）、シュワン細胞（S-100）、神経栄養因子（NGF,BDNF）について評価を行う予定である。
②本実験で使用しているコラーゲン性人工神経は、生体内では3か月から4か月程度経過することで自然と分解されてしまう構造となっている。分解されるまでに神経再生が起こらないと改善は難しい。この点を改善するためにわれわれは非吸収性で、生体親和性に乏しいPoly-tetra-fluoroethylene（テフロンシート）を用いて実験を行う。
具体的には、10mmの人工神経にテフロンをラッピングした群としなかった群で再生がどのように変化するかを調べる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
代表者である林礼人が、2022年10月～横浜市立大学形成外科に主任教授として異動し、基礎研究を一時的に中断しなくてはならない状況になったため、次年度へと使用を持ち越した。
異動後に基礎研究を行う体制を構築し、予定していた基礎研究を継続していきたいと考えており、遺伝子改変動物の移動や新たな実験室での飼育、評価のために必要な蛍光実体顕微鏡の移転費用などに使用する計画である。
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