| 研究課題/領域番号 |
21K09823
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
二藤 彰 鶴見大学, 歯学部, 教授 (00240747)
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| 研究分担者 |
出野 尚 鶴見大学, 歯学部, 助教 (40435699)
江面 陽一 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (50333456)
中島 和久 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (90252692)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 分化 / Line1 / レトロトランスポゾン / 軟骨細胞 / 間葉系細胞 |
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| 研究実績の概要 |
前年度と同様に、public data base(NCBI) にdeposit されたSRR公開データをSTAR でマッピング処理後、githubのsource code L1EM(https://github.com/FenyoLab/L1EM)とTE-transcript (https://github.com/mhammell-laboratory/TEtranscripts) 使って解析した。本年度はそれらに加えて、新たにマウス肢芽間葉系の分化におけるLine1遺伝子群の解析を行った。すなわち胎生11.5日の肢芽を取り出しその初代培養細胞を用い、回収分離後培養プレートに撒く直前、撒いた直後、培養経過数日後、さらには細胞凝集塊再形成後の in vitroの細胞分化過程などにおいて経時的にRNAを回収した。その上で抽出したRNAについてRNA sequencing 解析（外部機関への解析発注）を行った。得られたfq.gzファイルについて、解凍・展開後、trim_galore にてtrimming、さらにSTAR でマッピングを行い、コマンドラインでL1EM解析を行った。その結果29種のサブファミリーに分かれるLine-1 transcripsが得られた。とりわけL1MdTf_I L1MdTf_II L1MdTf_IIIなどのファミリー発現量が高く、しかも培養条件に応じた発現変動が見られた。また同じLine-1サブファミリーが、公開データで得られた別の間葉系細胞分化でも変動していることが確認され、それらが何らかの重要な機能を持つ可能性が示唆されている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Transposable element の発現をゲノムワイドに解析するのは容易ではなく、様々な手法が開発されその長所短所についての比較が報告されている（https://doi.org/10.1038/ s41576-020-0251-y ）。実際同じシークエンスデータについてL1EMとTE-transcriptで解析してみると、前者はlocus level でのregulation が得られるが、後者では比較する条件間での特定のTransposable elementの発現量の比較が容易にできるが、個別のlocus levelでの解析結果は示さない。しかも前者については、マッピングのパラメータを変えただけでも結果が変動する。それらの試行錯誤を経て現在trim_galore、 STARあるいHisat2を経てL1EMとTE-transcriptという比較的安定した解析方法を行うことができている。それによりRNA回収、RNA sequencing を経てfq.gzファイルからのコマンドラインを用いて初代培養細胞での発現解析も可能となった。安定した解析方法の樹立には時間がかかってきたが、ほぼ順調に進んでいると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
L1EM解析ではLine-1 transcrips のlocus level でのregulation結果が示されるが、多くのlocusで変化するため大量のエクセルデータとして示される。従って、特定のlocusでの発現が異なる条件や細胞でどのように変動するかという比較を行うためには、更なる解析方法の開発が必要になる。それを外部協力者の援助を受けて行う予定である。また機能解析を行う予定であり、その準備も開始している。多種であり発現量の高いLine-1 transcripsをどのように抑制するかという現状での課題であり、これまでspecific antisense oligonucleotides (ASOs) が有効であるという報告があるが、高額な費用であることから別のアプローチを探っている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度もPC-Linux によるpublic data base(NCBI)の公開データを自前で手に入れたgithubのsource code使って解析することが多かったこと、また細胞を使った実験も行いその解析も行ったが、その数も限られており、次年度使用が生じた。対面式での学会発表は復活したが、学会時の滞在日数が少なく旅費の執行は計画を下回った。次年度では、さらに細胞を使ったRNAサンプルをRNAシークエンス解析として外部機関へ委託する予定であり、その実験費用に充当する予定である。
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