| 研究課題/領域番号 |
21K09864
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
福田 信治 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (70398238)
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| 研究分担者 |
横川 慧 愛知学院大学, 薬学部, 講師 (40804406)
鈴木 崇弘 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70298545)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | EGFファミリー / エクトドメインシェディング |
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| 研究実績の概要 |
高齢化に伴い、日本の口腔がん罹患率は増加を続けている。肺がんや乳がんなどに比べ、口腔がんに特化した抗がん剤開発が遅れていることも問題である。このため、口腔がんの病態に関わる分子機構の解明や、治療標的となり得る分子群の特定は重要な課題となっている。本研究では、研究代表者がこれまで研究を進めてきた増殖因子EGFファミリーとEGF受容体シグナル伝達経路に焦点をあて、同リガンドファミリーが歯肉がん細胞の増殖や転移に果たす役割を明らかにする。
EGFファミリーの分子が細胞表面でどのように分布するかを顕微鏡下で可視化するため、EGFファミリーの一員であるAmphiregulin (AREG)を発光酵素Gaussia Luciferase (GLase)との融合タンパク質として発現するプラスミドを構築した。発光顕微鏡を用いた観察を行うため、骨肉腫細胞HT1080に遺伝子導入したところ、AREGは細胞表面に検出され、分泌の瞬間が捉えられた。細胞が進展しているleading edgeの部分は特に顕著な極在が認められた。野生型GLaseは一過的に発光し、細胞表面における持続的な観察が難しいため、長時間撮影を可能にする変異体GLaseを構築し、AREG-GLaseのライブイメージングを行なった。現在、基質であるセレンテラジン濃度など、安定的にAREGを撮影するための条件検討を進めている。またEGFファミリーメンバーであるTGF-alphaとHB-EGFについても同様のプラスミド構築と歯肉がん細胞株Ca9-22の遺伝子導入条件の検討中である。
また、歯肉がんと骨との関連として、同発光システムを使った骨関連タンパク質の分泌解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
文献に基づいて発光酵素Gaussia Luciferase (GLase)の変異体を作製した。野生型GLaseは一過的に発光反応を起こすが、ロイシン置換変異体と融合したEGFファミリー分子は野生型と比べると細胞表面で比較的安定な発光を示すことが明らかになった。
ただし一過的な遺伝子導入によって発光を検出しており、さらなる解析には安定発現株の樹立があると考えられた。この安定発現株の樹立に時間を要しており、進捗がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒト歯肉がん細胞Ca9-22への遺伝子発現ベクターの導入条件を最適化する。頂側膜(apical) 側と基底膜(basal) の極性を持つイヌ腎臓尿細管上皮細胞MCDKII株にも同様に遺伝子導入し、EGFファミリー分子の分布を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度購入した遺伝子導入試薬などに残量があり、新規購入せずに引き続き使用できている。正常細胞および培養器具・試薬の購入費は繰り越している。
次年度はこれら正常細胞、および、イヌ腎上皮培養細胞の培養器具、遺伝子導入試薬、安定発現株の樹立のための試薬を購入予定である。
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