| 研究課題/領域番号 |
21K09896
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
湯本 浩通 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (60284303)
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| 研究分担者 |
木戸 淳一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (10195315)
稲垣 裕司 徳島大学, 病院, 講師 (50380019)
廣島 佑香 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 講師 (60545143)
尾崎 和美 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (90214121)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Outer Membrane Vesicle / 歯肉上皮細胞 / 炎症性サイトカイン / シグナル伝達 / MAPK |
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| 研究実績の概要 |
歯周病原細菌由来Outer Membrane Vesicle (OMV)の病原性と機能解析：歯周病のKey Stone細菌であるPorphyromonas gingivalis (Pg)由来OMV (Pg-OMV)は，ヒト歯肉上皮細胞において，Pg-LPS と比べて炎症性サイトカイン(IL-6やIL-8)の遺伝子発現やタンパク質産生を増加させた。
1.自然免疫機構への関与と細胞内シグナル伝達経路の解析： Pg-OMV は，MAPKs (ERK, JNK)やNF-kB経路を介して炎症性サイトカインの発現や産生を誘導した。
2.Pg-OMVに含有される核酸の病原性と機能の解析：Pg-OMVには，多量のDNAが含まれていたことから，MAPKs以外の細胞内シグナル伝達経路として，細菌由来のDNA成分に対する自然免疫応答誘導に重要な役割を示す細胞質内センサーであるSTINGに着目して検討を行った結果，特異的siRNAによるSTINGのDown-regulationにより，Pg-OMVによって誘導されるIL-6とIL-8のmRNA発現およびタンパク質産生が有意に抑制された。
3.病原因子欠損株由来OMVの病原性と機能解析： 1時間70℃で熱処理を行ってProtease活性を消失させたPg-OMVやPgの有する2種のproteaseであるArg-gingipain (Rgp)とLys-gingipain (KGP)共に欠損させたPgKDP株由来OMV でも炎症性サイトカイン遺伝子発現やタンパク質産生は増加した。
以上の結果より，Pg-OMV は多数の病原因子を含有しており，ヒト歯肉上皮細胞において複雑なシグナル伝達経路を介して炎症性サイトカインの発現誘導に関与していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1.Pg-OMV 刺激によりヒト歯肉上皮細胞株(OBA-9細胞)において，IL-6 およびIL-8の遺伝子発現およびタンパク質産生が未刺激と比較して有意に増加した。また，Pg-OMV 添加後の炎症性サイトカイン遺伝子発現はPg-LPS と比べて上昇し，PgKDP-OMV でも同等の発現を示した。
2.Pg-OMV は，OBA-9細胞のERK, JNK, p38 およびNF-κB のリン酸化を亢進した。さらに，STING のノックダウンによりIL-6 およびIL-8 の発現が抑制された。
これらの結果より，Pg-OMV は多数の病原因子を含有しており，ヒト歯肉上皮細胞において複雑なシグナル伝達経路を介して炎症性サイトカインの発現誘導に関与していることが示唆された。
当初の研究実施計画と上記の結果を考慮すると，おおむね順調に研究は進展していると評価される。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.歯周病原細菌由来OMVの破骨細胞分化への影響に関して，マウスマクロファージ細胞株(RAW264.7)を用いて，破骨細胞分化マーカーの発現をreal-time RT-PCRやWestern blot法やTRAP染色を用いて解析を行う。
2.MPC-polymerでヒト歯肉上皮細胞株をCoatingすることにより，歯周病原細菌由来OMVの炎症性サイトカイン誘導能を抑制効果について，ELISA法等を用いて解析を行い，臨床応用への可能性について検討を行う。
3.マウスの歯肉に歯周病原細菌由来OMVを注入し，歯槽骨吸収をmicro CTにて，また炎症や組織破壊に関する分子についてはreal-time RT-PCR，Western blot法やELISAにて，in vivoでのOMVの歯周病の発症および進行における影響を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は，これまでに購入・使用していた培地や試薬類に加えて，Total RNA抽出・精製Kitやreal-time PCR試薬等が十分に残っていたために，それらの新規購入が計画当初より少なく，研究費の繰り越しが生じた。また，OMVによる炎症性サイトカイン発現誘導機構の解明，すなわちシグナル伝達経路の解析を重点的に行った事からも研究費の繰り越しが生じた。
(使用計画)
次年度は、歯周病原細菌由来OMVの破骨細胞分化への影響に関して，マウスマクロファージ細胞株(RAW264.7)を用いて，破骨細胞分化マーカーの発現をreal-time RT-PCRやWestern blot法やTRAP染色を用いて解析する研究へ移行する為に，Western blot法や染色組織学染色に用いる破骨細胞分化マーカーに対する抗体の購入等にこの繰り越し分と次年度の研究費を使用する計画である。さらに，次年度は，in vivoでのOMVの機能解析を行うため，マウスを用いた動物実験を予定であり，動物実験を行う為の試薬が必要である。また，学会や論文での研究成果発表を今年度より多く行う予定であり，これらの事項にも繰り越し分と次年度の研究費を使用する予定である。
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