| 研究課題/領域番号 |
21K10028
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
松本 貴志 昭和大学, 歯学部, 助教 (00635039)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 睡眠時ブラキシズム / ５－HT２A |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、①効果的な5-HT2A高発現iPS細胞分化誘導法の確立、②5-HT2A高発現iPS細胞を用いたセロトニン受容体のSNP変異による受容体機能解析を礎とし、セロトニン受容体関連疾患治療薬を探索することを目的とする。
2021年度研究は①効果的な5-HT2A高発現iPS細胞分化誘導法の確立にあたり、(a)ブラキシズムおよび対象患者のiPS細胞の樹立、(b)iPS細胞のセロトニン分化誘導法の検討、(c)効率的な5-HT2A 高発現細胞の選択的培養法の検討を予定していた。
(a)睡眠時ブラキシズムの遺伝子的疾患特異モデルを確立するため、5-HT2A遺伝子上ｍのRs6313変異が認められたブラキシズム患者および変異を認めない対照の血液細胞よりiPS細胞を樹立した。樹立したiPS細胞については、ゲノム解析および各種評価により品質管理を実施した。
(b)樹立したiPS細胞について、安定したセロトニン関連遺伝子発現神経細胞への分化誘導方法について検討するため、実験遂行の準備としてポジティブコントロールおよびネガティブコントロールと成り得る分子生物学的因子の探索を行い同定した。誘導物質の濃度勾配による領域特異的神経細胞分化誘導法について検討し、比較的目的遺伝子の発現が多いとされる領域特異的な誘導を実施した。分化誘導した細胞より微弱ではあるが目的遺伝子の発現が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021度研究予定であった研究については概ね実施できている。
COVID-19の影響により、被験者の確保や研究施設の使用制限等があり、一部遂行に支障をきたす状況であった。それを踏まえ、研究目的としては不十分な進捗ではあるが、概ね良好であると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度研究は①効果的な5-HT2A高発現iPS細胞分化誘導法の確立にあたり、(a)ブラキシズムおよび対象患者のiPS細胞の樹立、(b)iPS細胞のセロトニン分化誘導法の検討、(c)効率的な5-HT2A 高発現細胞の選択的培養法の検討を予定した。
今後は2021年度予定で不十分であった(b)iPS細胞のセロトニン分化誘導法についてより高発現する分化誘導法を検討する必要がある。また、(c)効率的な5-HT2A 高発現細胞の選択的培養法を検討するため、下記の通り準備を進めている。
5-HT2A 高発現細胞を利用するため、生細胞での5-HT2A 発現レベルをモニタリングする方法が必要であり、効率性および細胞への影響について、適切な選別培養方法について下記２つの方法について検討する。(ⅰ)標的遺伝子のプロモーター領域を応用した蛍光標識によるモニタリング法：5-HT2A のプロモーター領域を挿入したGFP標識ウイルスベクターを作製し、iPS細胞へ感染させる。蛍光顕微鏡により発光強度の高いコロニー群を選別し抽出する。(ⅱ)ソーティングによる分取法：神経へ分化誘導したiPS細胞を5-HT2A抗体により蛍光標識し、フローサイトメトリーを用いて選別・培養する。
2021年度予定であった上記研究内容と2022年度予定の内容は、研究協力者と共に並行して進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度はCOVID-19の影響が大きく、研究施設の使用制限や、エフォートの著しい低下により、研究遂行に遅れが生じた。また、遂行予定であった内容についての試薬等は多数備えており、追加での発注が生じなかったことが理由としてあげられる。
2022年度も引き続き上記影響は考えられるが、2021年度遂行予定の研究内容を研究協力者と並行して遂行する予定である。
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