| 研究課題/領域番号 |
21K10196
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
伊藤 龍朗 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (60635126)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 複合バイオフィルム / C. albicans / S. mutans / 早期小児齲蝕 / 母子感染 |
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| 研究実績の概要 |
早期小児齲蝕(Early Childhood Caries: ECC)はバイオフィルム(B.F.)感染症の一つであり、臨床の場で頻繁に遭遇する。ECC患児の口腔B.F.(歯垢)からは S. mutansと共にCandida albicansが高頻度で検出され（ECCオッズ比5倍以上）とされ、さらには母子感染の可能性が示唆されている。またS. mutans-C. albicans複合B.F.モデルでは、S. mutans単一の場合と比較して、齲蝕病原遺伝子の発現上昇、菌体外多糖(EPS)と菌量の増加、実験動物へのより重篤な齲蝕誘発がみられる。したがって、ECCへの取り組みはB.F.研究の視点が必須となる。
齲蝕原性B.F.研究は実験室株の単一菌で得た成果が多い。しかし単一菌からなるB.F.環境は存在せず、また実験室株では本来の病原因子を欠落している可能性がある。一方、C. albicansとECCの関連を調査した疫学研究は「(1)患者情報の統計解析」と「(2)微生物プロフ ァイルの取得」にとどまっており、B.F.の 観点でECCとC. albicansの母子感染を解析した例はほとんどない。そこで、細菌と真菌が共存した複合B.F.を一単位とし、口腔からの分離株を用いて検討する 必要があると考えた。本研究では、ECC患児とその母親の試料からS. mutans-C. albicans複合B.F.を構築し、「B.F. の齲蝕関連因子と構造」という観点で、その病原性とC. albicansの母子感染を明らかにしていく。
令和４年度では、引き続き3歳以上の小児とその母親を対象に、生活背景の聴取、母子のdmf(DMF)歯(面) 数の記録、C. albicansとS. mutansの生菌数測定を実施した。同時に臨床分離株を作成し、C. albicansの母子感染をAP-PCRで評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和４年度では臨床分離株からB.F.を構築し、齲蝕関連因子と構造解析を行う予定であったが、20組の評価では解析の頑健性が低いと判断し、Caries群の被験者数を55組にまで増加させることとした。Caries群(子)ではCHROMagar上に緑色コロニー(C. albicans候補)を検出したが、CF群(子)では未検出であった。母子のペアの場合、緑色コロニー検出率はCaries群でそれぞれ25.5%(子)、63.6%(母)であった。一方CF群ではそれぞれ0%(子)と20.0%(母)であった。C. albicansの生菌数は多い順に、Caries群母(6.3E+04 CFU/ml)>Caries群子(2.8E+04 CFU/ml)>CF群母(1.4E+03 CFU/ml)であった。また検体由来のコロニー表現型からC. albicansを分離し、AP-PCRのバンドパターンに基づいて系統樹を作成することで遺伝的近縁関係と多型を評価した。今夏の論文投稿に備え、以上の成果を現在まとめている。
以上の理由から、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ハイドロキシアパタイトディスクモデルにて、臨床分離株を用いた複合B.F.アッセイを行う。複合B.F.の齲蝕関連因子として、B.F.中の生菌数、バイオマス、 EPS、齲蝕病原遺伝子(グルコシルトランスフェラーゼや耐酸性遺伝子)、酸産生能を定量し、その病原性を評価する。さらに共焦点レーザー顕微鏡により、臨床分離複合B.F.の3Dイメージングを行う。B.F.形成の過程でS. mutans, EPS, C. albicansそれぞれに異なる染色を施し、視覚的に構造を解析する。S. mutansのマイクロコロニーのサイズ、EPSの厚みと分布、C. albicansの菌糸形態、細菌と真菌の組み合わせパターンを主に観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画では臨床分離株を用いたB.F.実験を行う予定であったが、令和４年度ではCaries群の被験者数を増やすことでデータの充実を図ったため、臨床分離株のDNA抽出キット、DNA増幅キット、プライマー、DNA実験器具の購入に収まった。そのためB.F.実験関連試薬類の購入に至らず、次年度使用額として計上した。
(使用計画) 被験者の微生物学的プロファイリングは令和４年度にほぼ終えており、これまでの結果をまとめ成果発表を計画している。したがって、令和５年度では学会発表旅費、英文校閲および論文投稿料に次年度使用額を充てる。さらに、次の段階として臨床分離株のB.F.実験へ移行するため、培地、糖量測定キット、染色試薬およびB.F.実験器具（ハイドロキシアパタイトディスク）の購入代に次年度使用額を充てる。
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