| 研究課題/領域番号 |
21K10253
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
岡 広子 広島大学, 医系科学研究科(歯), 特任講師 (60452588)
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| 研究分担者 |
北川 雅恵 広島大学, 病院(歯), 助教 (10403627) [辞退]
宮内 睦美 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (50169265)
加藤 文紀 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (70452589)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 硬組織 / 石灰化 / メチル化 |
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| 研究実績の概要 |
2021年度は、メチル化アレイに先立って以前抜去歯検体で年齢との相関が認められたメチル化ターゲットについて、硬組織由来培養細胞で石灰化培養三週間後までの細胞を用いてメチル化の変化を検討した（リアルタイムPCRΔΔCT法および高解像度融解曲線分析)。しかし、その際の石灰化程度の細胞ではメチル化DNAの量的に有意な変化は認められなかった。そのため、硬組織由来培養細胞での石灰化条件の再検討（初回播種数、培養週数、添加因子、比較コントロール）を行い、アリザリン染色で石灰化程度を確認しながら未石灰化から石灰化後数週間までの状態の細胞を回収した。その後メチル化解析に向けて同培養細胞からDNAを抽出した。石灰化検討によりアレイで検証するサンプル数が増えたため、2021年度はメチル化アレイを行うことができなかった。2022年度はこの細胞サンプルでメチル化アレイを行い、変化のあったターゲットについて培養系で刑事的に検討を行う予定である。また、石灰化条件の検討に際しては、同培養系に添加するメチル化阻害剤の濃度検討も行った。
さらに、抜去歯検体については、収集している検体について組織学的計測（2021年度時点13検体）とリアルタイムPCR（同、26検体）での検証に向けて整理・調整した。歯根部から検討に必要なDNA量が得られなかった検体が複数個あり、歯根表面のセメント質の残量も少ないため、DNAの得られていない抜去歯牙についてはDNAの抽出条件を再度検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナ感染症対応のため実験設備での検討が遅れた。また、培養細胞の石灰化条件（播種数、培養週数、添加因子、比較コントロール）の再検討を行った結果、メチル化アレイ解析すべき検体数が当初の予定よりも増えた。そのため、メチル化アレイ解析にかかる費用も増額したが予算の前倒し請求の時期を過ぎていたためアレイ解析を2021年度中に発注できなかった。また、十分なDNA量が抽出できない抜去歯牙検体が複数あったため、再抽出の条件検討が必要となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度はまず2021年度中に準備した細胞検体を用いてメチル化アレイ解析を実施する。解析の結果候補ターゲットが検出された場合は、リアルタイムPCRを用いて培養細胞中のターゲット候補のメチル化の変化について量的検証を行う。
また、解析期間中に抜去歯検体の組織学的計測を開始するとともにDNA抽出を検討する。培養細胞でメチル化の変化が観測されたターゲットについて、抜去歯牙検体でもメチル化の変化を検証し、組織学的計測値との関連を検討するデータを蓄積する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症への対応により、実験室での作業時間が予定よりも十分にとることができなかった。培養細胞を持ちいて石灰化状態を再検討した結果、アレイで検証するサンプル数が増えたため2021年度に予定していたアレイ解析の予算が不足した。前倒し請求の期限を過ぎていたため、メチル化アレイでの解析は2022年度の予算と合わせて実施することとした。
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