| 研究課題/領域番号 |
21K10398
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
大津山 賢一郎 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (10432741)
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| 研究分担者 |
常岡 英弘 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授(特命) (40437629)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 猫ひっかき病 / ワクチン / 急性期診断 / 抗原バンク |
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| 研究実績の概要 |
CSD抗原の新たな同定法の確立および抗原蛋白質合成を試みた。抗原として同定した蛋白質がCSD感染防御抗原となることを確認するため、B. henselaeに感染させたウサギ血清を用いてWB解析を行った。結果、B. henselae感染ウサギ血清と反応していることから、我々が同定した蛋白質が感染防御抗原であることを示していた。今回、32kDaと42kDaの検出されたCSD患者血清を用いて独自の改良WBで検出した抗原となるB. henselaeの蛋白質を以下の手技手法で行った。I.B. henselae蛋白質（32kDaと42kDa）に反応するCSD患者血清をもちいて、B. henselae全菌と我々が新たに構築した免疫沈降法（詳細は論文掲載のため不記載）を行い、B. henselae蛋白質（32kDaと42kDa）を抽出した。II.抽出した蛋白質をSDS-PAGE電気泳動を行い免疫沈降に用いたCSD患者血清を1次抗体としてWB法を行う。検出された分子量と照らし、銀染色したSDS-PAGEのポリアクリルアミドゲルで検出した個所を切り取り、質量分析を行った。III.質量分析で選出された蛋白質遺伝子をPCR法で増幅し、大腸菌でクローニングする。次に発現ベクターpGEX-6p-1を用い、この遺伝子をGST融合蛋白質として大腸菌BL21(DE3)株に発現させ、発現した蛋白質をアフィニティカラムクロマトグラフィ法にて精製した。IV.精製蛋白質をCSD患者血清のWB法で同定して評価した。これらの結果32kDaで候補に挙がった9つについて検証したが同定に至らなかった。現在残りの候補抗原蛋白質の同定を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫沈降を行わない質量分析に比べ、新たに構築した免疫沈降法では候補となる蛋白質の数を減少させることに成功した。しかし、質量分析による抗原候補が10種以上挙がってきているため、現在抗原同定に至っていない。複数の候補が挙がる原因としては回収の際抗原以外の蛋白質を回収してしまっている可能性が高いため改善を行う必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在32kDaの残りの候補と42kDaの解析を行っている。さらに新たな免疫沈降法の改善を図り抗原候補となる4群の蛋白質を質量分析に掛ける予定である。その方法としては、抽出した蛋白質をSDS-PAGE電気泳動を行い免疫沈降に用いたCSD患者血清を1次抗体としてWB法を行う。検出された分子量と照らし、銀染色したSDS-PAGEのポリアクリルアミドゲルで検出した個所を切り取り、質量分析を行う。質量分析で選出された蛋白質遺伝子をPCR法で増幅し、大腸菌でクローニングする。次に発現ベクターpGEX-6p-1を用い、この遺伝子をGST融合蛋白質として大腸菌BL21(DE3)株に発現させ、発現した蛋白質をアフィニティカラムクロマトグラフィ法にて精製する。精製蛋白質をCSD患者血清のWB法で同定して評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【物品費】本年度に複数の抗原候補が挙がっていたため、１つの抗原検討に時間を要し、様々なアプローチで同定を試みていていた。その他の抗原候補の検討に用いる消耗品の購入を見送った。未使用額が生じた。この未使用額については令和4年度の研究費と併せて抗原同定の検討に用いる消耗品の購入に充てる。
【旅費】
本年度に参加した第91回日本感染症学会西日本地方会学術集会は、コロナ禍であり学会会場へは行かず、オンラインによる発表や参加を行ったため、旅費について未使用が生じた。この未使用額については令和4年度の学会への旅費、参加費と併せて使用する。
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