| 研究課題/領域番号 |
21K10518
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
永井 淳 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (00207961)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | シングルセルゲノム解析 / 全ゲノム増幅 / 混合血痕 / DNA型 / 個人識別 |
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| 研究実績の概要 |
現在の法医・鑑識科学分野では、単独試料からの個人識別は非常に高い精度を持って行うことが可能であるが、混合試料からの個人識別はソフトウェア等による統計学的手法を用いても困難な場合が多く、混合試料に関与した人物を確実に特定するための有効な方法は未だない。そこで本研究では、混合試料中の個々の細胞に着目し、全ゲノム増幅（WGA）法を含むシングルセルゲノミクス技術を利用して1個の細胞からDNA型を検出することにより、混合試料からの精度の高い個人識別法を開発することを目的とする。
今年度は昨年度に続き、乾燥混合血痕から単離した個々の白血球のDNA型解析を行うために必要となる基礎的手法の確立を目指した。まず、フローサイトメトリー法を用い白血球を単離する際の細胞標識として、主にヒトT細胞に発現するCD3に対する抗CD3抗体と、ヒト汎白血球抗原であるCD45に対する抗CD45抗体をそれぞれ使用して解析し、抗体の違いによる個人識別への影響を検討した。その結果、血液試料提供者の総アレル数に対する検出されたアレル数の割合の平均値は、抗CD3抗体を使用した場合には約55.3%、抗CD45抗体を使用した場合には約31.8%であり、本法では抗CD45抗体より抗CD3抗体の方が個人識別に有用であることがわかった。次いで、アレル・ドロップアウトによりDNA型フルプロファイルが得られない問題点を解決するために、シングルセルゲノム解析による個々の白血球の型判定結果を複数組み合わせる「重ね合わせ法」と、解析に用いたWGA産物の残余を混合する「WGA産物混合法」を考案し、それらによるDNA型フルプロファイリングが可能か検討した。その結果、「重ね合わせ法」では42サンプル、「WGA産物混合法」では30サンプルの使用でDNA型フルプロファイルが得られ、両方法とも関与者のDNA型が未知の混合血痕に適用可能であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度に続き、乾燥混合血痕から単離した個々の白血球のDNA型解析を行うための基礎的手法の確立を目指した。しかしながら、本研究に使用する全ゲノム増幅法はランダムプライマーを利用した多重置換増幅であるため、それに起因すると考えられるアレル・ドロップアウトがいくつかのローカスで生じ、単離した個々の白血球のDNA型フルプロファイルを得ることは困難であった。そこで、新たに「重ね合わせ法」と「WGA産物混合法」を考案し、DNA型判定に適用したところ、どちらの方法でも混合血痕に関与した人物のDNA型フルプロファイルを得ることができ、関与者のDNA型が未知の混合血痕にも適用可能であった。また、フローサイトメトリー法により白血球を単離する際の細胞標識として抗CD3抗体を選択することが、アレルの判定率の向上には必要であることがわかった。以上のように、当初の計画よりわずかに遅れたものの、研究はおおむね順調に進展しており、乾燥混合血痕からの高精度な個人識別法を開発するための主な道筋は立てられたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究により、乾燥混合血痕から単離した個々の白血球のDNA型フルプロファイルを得ることが可能となった。しかしながら、安定してDNA型フルプロファイルを得て、高い精度で個人識別を行うためには、DNA型フルプロファイリングを阻害する要因を出来るだけ排除する必要がある。その要因には、全ゲノム増幅法で使用するランダムプライマーに起因するアレル・ドロップアウトだけでなく、標的とする白血球の細胞寿命によるアポトーシスの影響も考えられる。そこで今後は、フローサイトメトリー法を用いて白血球を単離する際に、中・後期アポトーシス細胞を特異的に検出する蛍光標識Annexin VやPI等を利用した、アポトーシスによるDNA断片化以前の白血球を選択的に分取する手法について検討を進める。併せて、DNA型フルプロファイリングへのクラスター分析や主成分分析等の統計解析的手法の導入についても検討を行う。また、現在、アレルの検出率を上げるために、非混合血痕から回収した複数個の白血球をまとめて解析する手法を試み、４個以上の白血球を用いることで高い個人識別精度が得られることを確認しており、この結果を混合血痕にどの程度適用可能か検討する予定である。そして最終的には、実際の法医・鑑識科学的試料への応用として、申請者の研究室で保存している様々な環境下に置いた陳旧混合試料に本研究で確立した混合試料からの個人識別法を適用し、それらの結果も踏まえた上で、本法の有用性について総合的に検討する。
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