| 研究課題/領域番号 |
21K11605
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
竹中 康浩 日本医科大学, 医学部, 助教 (20586789)
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| 研究分担者 |
平崎 正孝 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10522154)
柿沼 由彦 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (40233944)
大畠 久幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (80256924)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | RNAシーケンス / 心筋細胞 / 老化マウス / トランスクリプトーム解析 / 老化マーカー / 分裂終了細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、老化個体の分裂終了細胞等に普遍的な新規遺伝子マーカーを同定し、分裂終了細胞の老化が個体の老化にどのように寄与しているのかを本老化マーカーの加齢におけるカイネティクス及び機能解析により解明することである。２０２１年度は心筋細胞および非心筋細胞の単離方法を確立し一部のサンプルについてRNAシーケンス解析を行った。以下計画書に記載した研究実施計画に沿って当該年度（２０２２年度）に実施した研究の成果について記載する。
１.老齢マウス心筋細胞の網羅的トランスクリプトーム解析
【目的】老齢および若齢マウス心筋細胞の網羅的トランスクリプトーム解析を行う。【研究成果】分裂終了細胞に特徴的な新規の老化マーカーを同定するために、まず若齢（１４-１６週齢）および老齢（１年齢）のマウス心臓からコラゲナーゼ還流法により心筋細胞を単離した。同時に分裂終了細胞と分裂細胞との比較を行う目的から分裂性の非心筋細胞についても調製した。次に若齢および老齢の心筋細胞および非心筋細胞からRNA精製を行い、RNAシーケンス解析に供した。
２.分裂終了細胞に特徴的な老化マーカーの同定とそのカイネティクス解析
【目的】トランスクリプトーム解析の結果から候補分子を絞り込み、分裂終了細胞に特徴的な新規老化マーカーを同定する。【研究成果】心筋細胞および非心筋細胞のRNAシーケンス解析により得られた結果からいくつかのGOタームに分けて候補老化マーカー遺伝子を絞り込んだ。その結果心筋細胞では一部のミトコンドリア関連遺伝子の発現が低下していることに加えてnon-coding RNAの一種である核小体低分子RNA (snoRNA)の発現が低下していることが明らかになった。ミトコンドリア関連遺伝子やsnoRNAの発現量低下は老齢心筋細胞に特徴的なものであり、分裂終了細胞の新規な老化マーカーとなりうることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
２０２１年度の実施状況報告書に記載の通り若齢および老齢マウスの心臓から心筋細胞の単離を試みたがいくつかの問題が生じたため条件検討にかなりの時間を要した。
また２０２２年度中に同定したsnoRNAの機能解析と細胞および個体老化との関連について現在も解析を行っているが以下の理由により進捗がやや遅れている。
（１）snoRNAは低分子RNAであり主に核内で働くため、ノックダウン実験やノックアウト実験による機能解析の報告が少なく技術的な困難がある。
（２）同定した候補snoRNAは多数あり、この中からさらに老化との関係を解析してより有力な候補を同定するためには時間や労力、予算の問題で限界がある。
現在（１）についてはCRISPR-Cas9システムを利用したsnoRNAノックアウト系を確立しつつあるところである。実験手技が確立されれば（２）の問題についても同じノックアウト系を適用して解析を実施する。
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| 今後の研究の推進方策 |
１.老齢マウス心筋細胞の網羅的トランスクリプトーム解析
【研究実績の概要】に記載の通り、心筋および非心筋細胞のRNAシーケンス解析についてはほぼ終了しているが、状況をみて解析数を増やす。
２.分裂終了細胞に特徴的な老化マーカーの同定とそのカイネティクス解析
１年齢マウス心筋細胞から得られたRNAシーケンス解析データについては、研究分担者の平崎 正孝氏により解析がほぼ終了している。
３.培養細胞を用いた新規老化マーカーの老化における機能解析
引き続き培養細胞等を用いてsnoRNAを中心とする新規老化マーカー分子の機能を解析する。遺伝子導入方法、一般的な細胞老化マーカー測定法、酸化ストレスやDNA損傷レベルの測定方法等については既に確立しており、直ちに実施が可能な状態である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
初年度の研究立ち上げのための試薬等の購入が計画していた以上に多くなってしまった。これにより、２０２２年度中に次世代シーケンス解析するための予算が足りなくなってきたため。
（使用計画）
２０２２年度に購入予定であった試薬や老齢マウスを２０２１年度中に大部分購入したため、２０２２年度に請求する額は減るものの、研究遂行する上で大きな問題はなかった。また２０２２年度の計画は、主に現在所属機関にて飼育中の老齢マウスからの心筋細胞採取とその次世代シーケンス解析が中心であり、今後は既に購入済みの試薬等を活用して同定した新規老化マーカー分子の機能を解析していく。
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