心筋細胞に毒性終末糖化産物が生成・蓄積して引き起こされる細胞障害の機序は何か？

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K11607
• 研究機関: 金沢医科大学
• 研究代表者: 高田 尊信 金沢医科大学, 総合医学研究所, 講師 (20515308)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 終末糖化産物 / 毒性終末糖化産物 / 心筋細胞 / 心臓線維芽細胞 / オートファジー / 膵島β細胞 / LC-3 / p62

研究実績の概要

すでにWistar/STラットの新生仔から摘出・回収した心筋細胞に、「ブドウ糖と果糖の代謝中間体であるグリセルアルデヒド（GA）」を添加して、「拍動は完全に停止するが、NADPH活性は低下しない条件」の蛋白質を抽出し、2次元電気泳動法により蛋白質を分離し、抗毒性終末産物（TAGE）抗体を用いたウェスタンブロット解析を行っている。この画像をもとに、TAGE化蛋白質の推定分子量と推定等電点を求めた。現在、上記と同じ条件で蛋白質を抽出する作業を繰り返し、高濃度の蛋白質抽出液をサンプルとして、2次元電気泳動をする実験に取り組んでいる。
TAGEを生成・蓄積し心筋細胞においてLC3-II/LC3-Iの比率が低下するにも関わらず、LC3-IIと対になるp62の蛋白質レベルには変動がない。これが心筋細胞特異的な現象であるのかを調べるために、ヒト膵島β細胞株1.4E7にグリセルアルデヒドを添加する実験を行った。その結果、グリセルアルデヒド濃度依存的なTAGE生成・蓄積、細胞生存率低下が明らかになった。さらに一定濃度のGAを添加した条件では、LC3-II、LC3-I、p62のすべての減少が認められた。これにより、TAGEを生成・蓄積した心筋細胞におけるLC3-IIとp62の蛋白質レベルの挙動が、細胞特異的なものである可能性が示唆された（Nutrients 2022, 14:332）。
心臓線維芽細胞にGAを添加することにより、細胞内TAGEの生成・蓄積が細胞死を誘導すること、反面、生理的な血中TAGE濃度の30倍のTAGE化ウシ血清アルブミンは、細胞死を引き起こさなかった。このことから、心臓線維芽細胞の細胞死は、細胞外TAGEではなく、細胞内TAGEにより引き起こされることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

心筋細胞を対象とする研究に関しては、2次元電気泳動と質量分析法を組み合わせた毒性終末糖化産物（TAGE）化蛋白質同定の作業について、予定通りには進まなかった。実験をするのに十分な蛋白質量を確保できなかったためである。
しかし、TAGEを生成・蓄積した初代培養心筋細胞における、オートファジー関連蛋白質LC3とp62の挙動が、ヒト株化膵島β細胞におけるそれらとは異なることが明らかとなった。このことにより、心筋細胞においてTAGE生成・蓄積とオートファジー阻害のメカニズムが、心筋細胞独特のものである可能性を見出すことが出来た。

今後の研究の推進方策

高ブドウ糖培地および高果糖培地で心筋細胞を培養することにより、TAGEの生成・蓄積が有意に増加することを証明し、さらに拍動低下やオートファジー関連蛋白質LC3およびp62の挙動が、従来の「ブドウ糖や果糖の代謝中間体である、グリセルアルデヒドを添加する方法」により引き起こされる現象を再現できるかを解析する。

研究成果

• [雑誌論文] The Association between Accumulation of Toxic Advanced Glycation End-Products and Cytotoxic Effect in MC3T3-E1 Cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Akiko Sakasai-Sakai, Takanobu Takata, Masayoshi Takeuchi
  • 雑誌名: Nutrients 巻: 14 ページ: 990-990
  • DOI: 10.3390/nu14050990
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Intracellular Toxic Advanced Glycation End-Products in 1.4E7 Cell Line Induce Death with Reduction of Microtubule-Associated Protein 1 Light Chain 3 and p62 (2022)
  • 著者名/発表者名: Takanobu Takata, Akiko Sakasai-Sakai, Masayoshi Takeuchi
  • 雑誌名: Nutrients 巻: 14 ページ: 332-332
  • DOI: 10.3390/nu14020332
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive analysis of protein-expression changes specific to immunoglobulin G4-related disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Takafumi Kawanami, Haruka Kawanami-Iwao, Takanobu Takata, Yasuhito Ishigaki, Naohisa Tomosugi, Tsutomu Takegami, HIroko Yanagisawa, Shino Fujimoto, Tomoyuki Sakai, Yoshimasa Fujita, Kazunori Yamada, Shuich Mizuta, Hiroshi Kawabata, Toshihiro Fukushima, Yuko Hirose, Yasufumi Masaki
  • 雑誌名: Clinica Chimica Acta 巻: 523 ページ: 45-57
  • DOI: 10.1016/j.cca.2021.08.025
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Accumulation of Toxic Advanced Glycation End-Products Induces Cytotoxicity and Inflammation in Hepatocyte-Like Cells Differentiated from Human Induced Pluripotent Stem Cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Chigusa Kikuchi, Akiko Sakasai-Sakai, Risa Okimura, Hinako Tanaka, Takanobu Takata, Masayoshi Takeuchi, Tamihide Matsunaga
  • 雑誌名: Biological & Pharmaceutical Bulletin 巻: 44 ページ: 1399-1402
  • DOI: 10.1248/bpb.b21-00520
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 生活習慣病における新たな概念Toxc AGEs（TAGE） (2022)
  • 著者名/発表者名: 竹内正義、逆井（坂井）亜紀子、高田尊信、瀧野純一、郡山恵樹、古川絢子、那須隆斗、菊池千草、長嶺憲太郎、堀隆光、松永民秀
  • 学会等名: 日本薬学会第142年会
• [学会発表] Accumulation of toxic advanced glycation end-products induces cell death and inhibits osteoblastic diffrentiation in MC3T3-E1 cells (2021)
  • 著者名/発表者名: 逆井（坂井）亜紀子、高田尊信、竹内正義
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 肝実質細胞内における毒性AGEs（TAGE）蓄積が酸化ストレスに及ぼす影響 (2021)
  • 著者名/発表者名: 逆井（坂井）亜紀子、高田尊信、瀧野純一、竹内正義
  • 学会等名: 第7回肝臓と糖尿病・代謝研究学会
• [学会発表] 生活習慣病の発症・進展予防における新規概念Toxic AGEs（TAGE）と食事療法 (2021)
  • 著者名/発表者名: 高田尊信、逆井（坂井）亜紀子、瀧野純一、竹内正義
  • 学会等名: 第64回日本糖尿病学会年次学術集会