| 研究課題/領域番号 |
21K11647
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| 研究機関 | 佐賀大学 |
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研究代表者 |
井原 秀之 佐賀大学, 医学部, 准教授 (50452834)
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| 研究分担者 |
江口 裕伸 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (60351798)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 活性型二量体形成 / FUT8 |
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| 研究実績の概要 |
アスパラギン結合型糖鎖の主要構造であるコアフコースの合成を触媒するFUT8の活性型二量体形成機構の詳細を明らかにするため、二量体形成において主要な役割を果たしていると考えられるα-helical ドメインの疎水性残基に着目し、標的疎水性残基のアラニンもしくはグリシンに置換した部位特異的変異体を作製し、細胞内での発現や酵素活性を指標に変異導入残基の二量体形成における重要性を明らかにした。
公表されているFUT8の立体構造の情報を基に、α-helical ドメイン内に位置する10残基の疎水性残基を変異導入残基の候補とし変異体酵素を作製した。作製した変異体酵素をCOS-1細胞内で一過性に発現させたところ、野生型酵素と比較してタンパク質発現量に変化は見られなかった。一方、変異体酵素のFUT8酵素活性を測定したところ多くの変異体で野生型と比較して30～50％の活性減少が観察された。特にIL163およびL167の変異体においては野生型と比較して約80%の酵素活性の減少が観察され、これらの残基が触媒ドメインに位置していないにもかかわらずFUT8活性の発揮に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、アラニンに置換した変異体よりグリシンに置換した変異体のほうが活性減少の程度が大きい傾向にあること、2残基変異体では著しい活性減少が観察されることから、FUT8のα-helical ドメインを介した二量体形成が疎水性相互作用によるものである可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
FUT8の二量体形成において主要な役割を果たしていると考えられるα-helical ドメインの疎水性残基の変異体を作製し、変異導入を行った疎水性残基残基がFUT8酵素活性に密接に関与することを明らかにすることができた。得られた実験結果は、FUT8の活性型形成機構の詳細を理解するための基礎的データとして重要であり、次年度の研究（阻害ペプチドや、ドミナントネガティブ変異体の開発）を発展させる上でも大変有用であると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、アルファスクリーン法（パーキンエルマー社）やブルーネィティブポリアクリルアミドゲル電気泳動法（BN-PAGE）を用いたFUT8二量体化評価システムを構築し、α-helical ドメイン変異体の二量体形成能を調べ、酵素活性減少と相関があるか確認する。報告済みであるシステイン導入変異体による新規ジスルフィド結合の形成を用いた二量体形成評価法もあわせて利用しFUT8の活性型二量体形成を定量的に確認していく。
また、変異導入実験の結果を基にFUT8二量体形成の阻害ペプチドや、ドミナントネガティブ変異体の開発についても検討していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度に参加した学会がオンライン開催になり、旅費を計画通り執行することができなかった。また研究実施時期の変更により、試薬購入のための予算を一部次年度に利用するよう変更した。次年度の研究費は、当該年度の研究計画を実施するために利用する予定である。
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