2022 年度実施状況報告書

脂肪細胞とマクロファージ共培養下における脂質代謝と炎症に及ぼす脂肪酸の効果

研究課題

研究課題/領域番号	21K11712
研究機関	神戸学院大学
研究代表者	藤岡由夫神戸学院大学, 栄養学部, 教授 (70299098)
研究分担者	眞本利絵神戸学院大学, 栄養学部, 実験助手 (60189892)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	heme-oxygenase-1（HO-1） / adipocyte / macrophage / fatty acid / lipid metabolism
研究実績の概要	脂肪細胞単独及び脂肪細胞とマクロファージ共培養下において、各種脂肪酸の脂肪細胞の脂質代謝関連遺伝子および転写因子を含むシグナル伝達機構への関与を調べ、脂質代謝調節を明らかにすることを題材とし、脂肪細胞における抗炎症作用、抗酸化作用を有するheme-oxygenase-1（HO-1）に焦点をあてた。2022年度では飽和脂肪酸のパルミチン酸、ステアリン酸、一価不飽和脂肪酸のパルミトレイン酸、オレイン酸、多価不飽和脂肪酸のアラキドン酸、EPA、DHA、トランス脂肪酸のパルミトエライジン酸、エライジン酸、トランスバクセン酸が脂肪細胞HO-1発現に及ぼす影響を検討した。またNF-kBとTNF-αの活性化も検討した。単独培養、マクロファージと共培養した3T3-L1脂肪細胞に各種脂肪酸を負荷した。 HO-1蛋白質発現は、飽和脂肪酸のうち単独培養時にステアリン酸とパルミチン酸、共培養下にパルミチン酸で有意に低下、ステアリン酸で低下傾向であった。一価不飽和脂肪酸では両条件とも著変は認めなかった。多価不飽和脂肪酸では、単独培養時にEPAとDHA、共培養下にDHAで有意に上昇し、共培養下にアラキドン酸で有意に低下した。トランス脂肪酸では単独培養時にエライジン酸、共培養下にパルミトエライジン酸とエライジン酸で有意に低下した。 NF-kBの活性化は、単独培養時でいずれの脂肪酸でも上昇したが、共培養下でEPAとDHAで減少する傾向が見られた。培養上清中のTNF-α量は単独培養ではどちらも有意な差が見られず、DHAでは有意に共培養で濃度依存的に減少がみられた。このことから脂肪酸の種類によってHO-1発現とNF-kBの活性化に何らかの機序が関わっている可能性があることが示唆された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由令和3年度及び4年度以降に脂質代謝関連酵素[ホルモン感受性リパーゼ（hormone sensitive lipase : HSL）、脂肪細胞特異的TG リパーゼ（adipose triglyceride lipase : ATGL）、中性コレステロールエステル分解酵素（Neutral cholesterol ester hydrolase 1 : NCEH1）]、コレステロール排出機構に関わるATP 結合カセットトランスポーターA1（ABCA1）とG1（ABCG1）、そしてスカベンジャー受容体（SR-B1、CD36）の蛋白発現量をウェスタンブロッティング及びmRNA の発現をリアルタイムPCR 法での解析を行う予定であったが、細胞上清中の炎症関連サイトカインであるTNF-α、ライセートから転写因子NF-κBをELISA法で測定するのに時間を要したため、後れている状況である。
今後の研究の推進方策	現在まで令和3年度に作成し保存しているウェスタンブロッティングとリアルタイムサンプルを用いて様々な脂肪酸負荷後の脂質代謝関連酵素[HSL、ATGL、NCEH1、ABCA1とABCG1、そしてSR-B1、CD36の蛋白発現量、mRNA 発現に順次測定する予定にしている。同様に保存してある上清を用い様々な脂肪酸負荷後の細胞上清中の炎症関連サイトカインである、IL-1α,β をELISA 法で測定する。Ｎrf2 測定用の核抽出液を作成し、ELISA法で測定する。シグナル伝達経路（Nrf2、ERK、p38 MAPK、AP-1、PI3K/Akt、NF-κB を含めた炎症制御機構）の変動についてもキットで測定する。発現抑制からみたHO-1 発現調節の解明のため効果を認めた脂肪酸の条件下で、HO-1 や転写因子および関連遺伝子、シグナル伝達経路の変動をウェスタンブロッティング法あるいはリアルタイムPCR法、その他キットでRNAi 法や阻害薬を用いて発現を検討する。シグナル解析も行う。
次年度使用額が生じた理由	当初の研究計画では、令和4年度12月までにHO-1関連酵素及び蛋白発現に関する実験（ウェスタンブロッティング及びリアルタイムPCR）を終了し、その後、転写因子Ｎrf2 及び炎症関連サイトカインであるIL-1α,βをELISA 法で測定する予定でいたが、蛋白発現解析やNF-κBの測定に新たに数か月を要したため、NF-κB やTNF-α、IL-1α,βとの測定が遅れた。また使用するトランスウェルプレート製造中止のために型番の変更を要し、それまで国内在庫があったが、海外発注をしなければならない事態に陥り、入手に時間を要することが判明したため、年度内完了が困難となった。現在、試薬は発注継続であり、令和４年度に入手次第、HO-1関連酵素及び蛋白発現に関する実験を行い、HO-1 発現におけるシグナル伝達経路の実験を行う予定をしている。