| 研究課題/領域番号 |
21K12129
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
山岸 賢司 日本大学, 工学部, 准教授 (90460021)
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| 研究分担者 |
坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369)
石川 岳志 鹿児島大学, 理工学域工学系, 教授 (80505909)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | RNAアプタマー / 分子動力学計算 / フラグメント分子軌道計算 / 計算化学 / 分子シミュレーション / 表面プラズモン共鳴 / 等温滴定型カロリメトリ / 分子設計 |
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| 研究実績の概要 |
RNAアプタマーは抗体に代わる次世代技術として、医薬品分野や診断薬分野などで注目されている。本研究は、申請者が蓄積してきたアプタマーに対する研究成果をもとに、RNAアプタマーが標的タンパク質をどのように認識し結合するのか、その分子認識メカニズムを計算化学手法により明らかにする。そして、アプタマー設計にはじめて計算化学という手法を取り入れ、論理的な観点から新しいRNAアプタマーを設計する基盤技術の構築を目指すものである。
当該年度では、抗体のFc領域に対して結合するRNAアプタマーに対して、これまでの研究を通じて蓄積した知見に基づき、新たな配列や化学修飾を有する新規RNAアプタマーをいくつか論理的に予測することができた。予測した新規RNAアプタマーに対しては、分子動力学(MD)計算を行い、その立体構造の解析を行った。RNAアプタマーに対する立体構造の解析では、まず、RNAアプタマーの構造に特有な局所的な構造変化を解析した。さらに、RNAアプタマー構造の揺らぎを視覚的に評価する解析技術や、標的分子との結合状態を評価する解析技術を確立した。またMD計算のトラジェクトリ―から、RNAアプタマーの構造をサンプリングし、フラグメント分子軌道(FMO)計算を用いて、RNAアプタマーと抗体との分子間相互作用の解析を行った。これらの解析を通じて、RNAアプタマーの配列の違いやRNAアプタマーに対する化学修飾が、RNAアプタマーの立体構造やその標的分子である抗体との相互作用に与える影響を解析した。
またin vitro実験では、論理的に予測した新たな配列や化学修飾を有するRNAアプタマーを実際に化学合成し、バイオレイヤー干渉法（BLI）法および表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いて、RNAアプタマーとその標的分子である抗体との分子間相互作用を解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、RNAアプタマーとその標的タンパク質との結合力を予測する手法を確立し、論理的な観点から新しいRNAアプタマーを設計する基盤技術を確立することを目的に、計算化学、およびin vitro解析の両面から取り組んでいる。
計算化学による研究では、これまでに核酸分子であるRNAアプタマーに対して分子動力学計算を行うプロトコルを確立してきた。すでに、配列や化学修飾が異なる種々のRNAアプタマーに対して分子動力学計算を実行し、動的な構造の解析を進めることができている。分子動力学計算による構造解析では、RNAアプタマーの構造に特有な局所的な構造変化に着目するだけでなく、RNAアプタマー構造の揺らぎを視覚的に評価する解析技術や、標的分子との結合状態を評価する解析技術なども確立してきた。現在、分子動力学計算のトラジェクトリ―からRNAアプタマーの構造を抽出するため、サンプリング方法の検討を進めている。
in vitro実験では、抗体に結合するRNAアプタマーに対して、バイオレイヤー干渉（BLI）法や等温滴定型カロリメトリ（ITC）により解析するための実験条件等を確立し、RNAアプタマーと標的分子との相互作用の解析を進めることができている。また、高分解能NMR分光計を用いた解析についても、その実験条件等を確立することができており、RNAアプタマーの結合状態について原子レベルで解析を進めている。このように、新たな配列や化学修飾を有する新規アプタマーの作用機序をin vitroで解析するための技術的な準備もできている。
以上より、RNAアプタマーを論理的に設計する基盤技術の構築に必要不可欠な種々の解析を申請書記載のとおり進めることができており、おおむね順調に進んでいると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNAアプタマーと標的タンパク質との結合力を予測する手法を確立し、新しいRNAアプタマーを効率的に設計する基盤技術の確立を目標に、計算化学、およびin vitro解析の両面から以下の研究に取り組む。
計算化学による解析では引き続き、抗体のFc領域に対して結合すると予測した新たな配列や化学修飾を有する新規RNAアプタマーに対して、分子動力学計算を用いてRNAアプタマーの動的な構造変化を解析する。RNAアプタマーの配列の違いやRNAアプタマーに対する化学修飾が、RNAアプタマーの立体構造にどのような影響を与えるか網羅的に解析を進める。さらに、研究分担者の石川により開発された、フラグメント分子軌道法に基づき生体分子間の静電的相補性を視覚的および定量的に解析できるVIINEC法を用いて、予測した新規RNAアプタマーと標的分子との分子間相互作用を解析する。
in vitro実験では、予測した新規RNAアプタマーに対して、すでにバイオレイヤー干渉（BLI）法および表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いて、結合速度定数konおよび解離速度定数koffを解析し、RNAアプタマーとその標的タンパク質である抗体との相互作用の解離定数Kdを明らかにしてきた。今後は、熱力学的に解析できる等温滴定型カロリメトリ（ITC）による相互作用解析も行い、RNAアプタマーと抗体との結合のエンタルピー変化ΔH，エントロピー変化ΔS，および化学量論比Nを明らかにしていく。
このようなin vitro解析により得られた相互作用の熱力学パラメータと計算化学により得られる相互作用エネルギーや静電的相補性とを照らし合わせ、計算化学に基づく新規アプタマーの予測を検証・フィードバックする。そして、RNAアプタマーが標的分子をどのように認識し結合するのか、その分子認識メカニズムの理解を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ワークステーションの購入を予定していたが、世界的な半導体不足による価格高騰と納期が大幅に伸びている現状から、当該年度でのワークステーションの購入を見送った。研究計画の遂行に大きな支障が生じないよう、研究代者が所有するワークステーションの運用を調整し、本研究の遂行に必要なシミュレーションを実施している。次年度以降、市場動向を鑑みながら、適切なタイミングでワークステーションを購入する予定である。
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