| 研究課題/領域番号 |
21K12243
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
児玉 靖司 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00195744)
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| 研究分担者 |
白石 一乗 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (40347513)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | DNAリガーゼⅣ / DNA2本鎖切断修復酵素 / 非相同末端結合 / 放射線感受性 / 神経幹/前駆細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、酵素活性ドメインに新規遺伝子変異を導入したDNAリガーゼⅣ（Lig4）がどのようなDNA２本鎖切断（DSB）修復異常を示し、さらにそのDSB修復異常がどのような生体影響を誘発するのかを明らかにすることである。そのために、本研究は、Lig4酵素活性ドメインの447番目のアミノ酸が、トリプトファン（W）からシステイン（C）に置換された（W447C）変異マウス（Lig4W/W）を材料に用いた。2021年度の研究実績は、以下の① - ③に示す通りである。① Lig4W/Wマウス由来細胞におけるDSB修復不全効果については、X線被ばく後の核当たりのリン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）フォーカス数をDSB数の指標として、Lig 4ヘテロ変異マウス（Lig 4+/W）由来細胞を対照として調べた。その結果、Lig 4 W/Wマウス由来細胞は、Lig 4+/Wマウス由来細胞に比べて、DSB修復速度が遅く、神経幹/前駆細胞では被ばく後6時間、また、線維芽細胞では12時間までDSB数が有意に低下しないことを明らかにした。次に、② Lig 4 W/W変異が、細胞増殖能や細胞老化に及ぼす影響について調べた。その結果、Lig4W/Wマウス線維芽細胞では、より多くの自然発生DSBが蓄積し、それが増殖速度の低下とともに細胞老化を促進していることを明らかにした。さらに、③ マウス線維芽細胞を不死化し、その細胞を用いてX線致死感受性について調べた。その結果、Lig4W/Wマウス線維芽細胞では、長期継代培養による細胞不死化過程において、Lig 4+/Wマウスや野生型マウス由来線維芽細胞に比べて、多数の染色体断片が出現することを明らかにした。また、不死化細胞を用いてX線生存率を解析した結果、Lig4W/Wマウス由来細胞は野生型マウス由来細胞に比べて、約4倍高感受性であることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究全体は、これまでのところ、ほぼ順調に推移しており、現在までに、④ 染色体異常、姉妹染色分体交換（SCE）、及びテロメアSCE（T-SCE）の解析、及び⑤ ライブセルイメージングを用いた小核誘発とその運命の解析、及び⑥ X線被ばくしたLig4W/Wマウスについて、6週間後に遅延性に発生するDNA2本鎖切断（DSB）数の解析を予備的に実施した。その結果、実験⑤と⑥については、実験計画の変更が必要であることが明らかになった。⑤のライブセルイメージング解析では、Lig 4 W/Wマウス不死化細胞への蛍光色素遺伝子の導入効率が極端に低いことが明らかになり、現在までに、まだ細胞核を可視化した安定Lig4W/W細胞株が得られていない。そのため、ライブセルイメージングによるLig4W/W細胞の被ばく後の運命について、細胞世代を追跡した系譜解析が実施できない状況にある。また、⑥の遅延性DSB数の解析については、胎児期に被ばくしたLig 4 W/Wマウスの生存率が低いために解析数が十分確保できないことが分かった。これについては、細胞レベルでX線被ばく遅延性影響が解析できないかを検討する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、取り組むべき３つのプロジェクトについて、以下の様に進める予定である。④ 染色体異常、姉妹染色分体交換（SCE）、及びテロメアSCE（T-SCE）の解析については、計画通り進める。Lig4W/W細胞では、X線で誘発されたDSBの修復に係る非相同末端結合の最終ステップが完結しないので、切断型染色体異常が増加すると予想される。さらに、野生型細胞に比べてLig4W/W細胞は、DSB修復が相同組換えに偏重している可能性があり、その場合には、相同組換え機構を介する姉妹染色分体交換（SCE）やテロメアSCE（T-SCE）の頻度が高くなると予想されるため、これらを検証する。また、⑤ ライブセルイメージングを用いた小核誘発とその運命の解析については、計画を一部変更し、蛍光色素遺伝子の一過性発現可視化細胞を用いた小核の追跡解析を検討する。さらに、⑥ 放射線被ばくによる遅延性DSB誘発解析については、計画を変更し、被ばくしていないLig4W/W細胞に被ばく染色体を移入してその安定性を調べる方法（染色体移入法）により、Lig4ホモ変異（Lig4W/W）が、X線誘発遅延性染色体不安定性に及ぼす影響を調べる実験系を検討する。
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