| 研究課題/領域番号 |
21K12316
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| 研究機関 | 熊本高等専門学校 |
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研究代表者 |
富澤 哲 熊本高等専門学校, 生産システム工学系BCグループ, 講師 (90634709)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 生分解性 / バイオマス / カーボンニュートラル / プラスチック |
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| 研究実績の概要 |
耐熱性の向上を期待して、主鎖に二重結合を含むプラスチックの発酵生産を目指している。はじめに、主鎖方向に長いモノマー（6-ヒドロキシヘキサン酸：6HHx）に対して活性を示す微生物とプラスチック合成関連の酵素を取得する。続いて、主鎖に二重結合を含む炭素源（不飽和脂肪酸）を用いて、主鎖に二重結合 を含むプラスチックの発酵生産を行う計画である。本年度は3項目について取り組んだ。１．Bacillus属細菌をについて10-ヒドロキシデカン酸(10HD)を炭素源とした培養を行った。ε-カプロラクトン(CL)、CLを開環した6HHxを炭素源とした場合、4HB成分が多くなり、6HHx成分はごくわずかだったためである。８HOや10HDを炭素源とすれば、細胞内で6HHx成分が供給されることを期待した。しかしながら、6HHxの検出はできなかった。２．メタノール資化細菌の単離について、Bacillus属細菌の他に6HHx成分を蓄積する微生物としてメタノール資化細菌の報告がある。そこで、10HDを炭素源としたメタノール資化細菌の単離を行った。調査の炭素源を与えることで細胞内での6HHx成分の供給を期待した。今年度得られた微生物は一般的な成分である3-ヒドロキシブタン酸（3HB）のホモポリマーを蓄積が確認できた。目的とする6HHxを蓄積する微生物の単離はできなかった。３．プラスチック合成酵素の基質はヒドロキシアシルCoAであるため、脂肪酸末端に水酸基を導入する必要がある。そこでPseudomonas属細菌よりクローニングを行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
校舎改修による別の建物への引っ越しと工期延長、それに伴う機器利用の制限により予定の実験をこなせなかった。また、Bacillus属細菌による6HHx成分の蓄積について再現性に乏しい結果となった。
１．Bacillus属細菌を用いた培養とプラスチック合成遺伝子の取得について、脂肪酸分析に適したカラムを装備したガスクロマトグラフィー（GC）を導入したため、Bacillus属細菌の培養条件による6HHx成分の向上を試みた。いずれの条件でも6HHx成分の向上は見られなかった。そこで、10HDのような長鎖の脂肪酸を炭素源とした培養を行った。同様に6HHx成分は検出できなかった。細胞内で6HHxはプラスチック合成酵素に供給されていないもしくは6HHxに対する活性が極めて低いと予想できた。
２．6HHxまたは10HDを炭素源としたメタノール資化細菌の単離に取り組んだ。6HHxを用いた場合、3HBのホモポリマーもしくは3HBと4HBの共重合体を蓄積する微生物を取得できた。10HDを炭素源とした場合は3HBのホモポリマーを合成する微生物が得られた。
３．不飽和脂肪酸を含む微生物の培養について、微細藻類であるオーランチオキトリウムの培養条件を検討した。グルコースを炭素源として、ドコサヘキサエン酸（DHA）をはじめとした不飽和脂肪酸の蓄積をGCで確認できた。菌体抽出液や破砕液から得られた不飽和脂肪酸を炭素源としたプラスチック生産に活用できる。また、生産した不飽和脂肪酸を原料として、触媒反応によりベンゼンの前駆体である1,4-シクロヘキサジエン（1,4-CHD）を得た。不飽和脂肪酸や脂肪酸をプラスチック合成酵素に供給する際には、そのメチル末端に水酸基を導入する必要がある。そこでPseudomonas属細菌よりクローニングを行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．プラスチック生産が可能なベクターを作成し、組み換え大腸菌によるプラスチック生産を試みる。プラスチック合成酵素の遺伝子、脂肪酸末端に水酸基を導入する遺伝子、脂肪酸カルボキシル基末端にコエンザイムAを結合する遺伝子を準備し、大腸菌や生体外酵素反応を実施する。また、プラスチック合成酵素の基質合成を行う。
２．メタノール資化細菌の単離については炭素源を変更して継続する。10-ヒドロキシデカン酸、8-ヒドロキシオクタン酸を炭素源として、主鎖方向に長いプラスチックを生産する微生物の単離を行う。この脂肪酸は細胞内で分解される過程で6HHxを経るため、6HHx蓄積微生物の単離が期待できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
真空ポンプの購入を想定していたが、研究室移転後に別予算での購入が可能となった。そのため、基質や脂肪酸の分離を目的とした分取機器を導入した。また、Bacillus属細菌の培養実験にこだわりすぎたので、次年度はクローニング関連試薬、基質合成試薬を購入して実験を進める。
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