| 研究課題/領域番号 |
21K14777
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
藤原 良介 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (60880797)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Methylorubrum extorquens / Metabolic engineering / 発酵生産 / 廃グリセロール / メタノール / グリセロール |
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| 研究実績の概要 |
メタノールおよびグリセロールを同時に資化可能なM. extorquens代謝改変株の構築を行った。M. extorquens野生株に対してputative glycerol kinase(Mext_4066) をプラスミドを利用して過剰発現させることで、グリセロール単一炭素源での増殖を確認した。続いてゲノム上に同遺伝子を組み込んだ株を構築し、同様の培地での培養を行ったが、細胞増殖速度は野生株と同程度であった。このことからグリセロールの効率的な資化にはMext_4066をプラスミドにより高発現させる必要があることが示唆された。
また、メタノール由来の炭素を目的生産物に効率的に利用するため、競合反応を触媒する酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)の破壊を行った。接合伝達大腸菌を用いた遺伝子破壊の操作において、大腸菌-M. extorquens混合培養体からM. extorquensのみを得るために大腸菌が増殖できないメタノール培地での培養を行うステップがあるが、本研究ではメタノール資化経路の破壊を行うため、別の原理によるスクリーニング法の開発が必要となった。そこでクロラムフェニコール耐性遺伝子をゲノム上に組み込み、新たな遺伝子破壊操作プロトコルを確立した。この遺伝子破壊プロトコルを用いて、3つのFDH遺伝子(Mext_4582, Mext_0389, Mext_4405-4406)を破壊した3重破壊株の作成に成功した。現在、残る1つのFDHアイソザイムであるFDH4(Mext_2105)の破壊株を構築中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
内在遺伝子の過剰発現によってグリセロール資化能が強化されることは確認済みである。また本研究の遂行上必須となる遺伝子破壊操作のプロトコルを確立した。一方で、1つの遺伝子破壊にかかる時間が想定よりも長く、当初予定していた遺伝子破壊を全て実施することが出来なかった。これは遺伝子破壊株の増殖速度に依存しているため、破壊にかかる期間を劇的に短縮することは難しいと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き遺伝子破壊株の構築を行う。これまでの研究から、ギ酸からCO2へのフラックスを遮断するにはM. extorquensは保有する4つのFDH全てを破壊する必要が有ることが知られている。現在の3重破壊株をもとにFDH完全欠損株を作成し、基質としてのメタノールが全て目的生産物へ変換される代謝可変株の獲得を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定の実験機器の欠品により購入できなかったた。代替品を購入し実験を遂行する予定である。
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