| 研究課題/領域番号 |
21K14830
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| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
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研究代表者 |
山田 泰之 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (20770879)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | イソキノリンアルカロイド / ハナビシソウ / ジャスモン酸シグナル伝達系 / 転写制御ネットワーク / MYC2 / COI1 / JAZ |
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| 研究実績の概要 |
植物が産生する特化代謝（二次代謝）産物は有用だが植物中の含量が少ない上に化学合成が難しいものも多く、安定供給系の確立を志向した生合成機構の解明は喫緊の課題である。研究代表者は、医薬品原料として有用なものも多いイソキノリンアルカロイド（IQA）の生合成機構の解明に長年携わり、IQA産生植物にユニークなbHLH転写因子などの存在を明らかにしてきた。IQAの産生とその生合成酵素遺伝子の発現は植物ホルモンであるジャスモン酸（JA）によって誘導されるが、植物普遍的に存在するJAシグナル伝達系のコア複合体（COI1-JAZ-MYC2）との関連性は不明であった。特に、IQAでは前述のユニークなbHLHが重要な機能を担っていると考えられており、JAシグナル伝達に関わる制御因子ネットワークは他のアルカロイド生合成系とは異なる可能性も考えられた。そこで、本研究ではIQA産生植物にユニークなbHLHが関わるIQA生合成系のジャスモン酸シグナル伝達機構の詳細を明らかにし、植物有用特化代謝産物の安定供給に繋がる応用研究基盤を構築することを目的としている。
2022年度も前年度に引き続き、JAシグナル伝達系のコア因子であるCOI1やJAZ、MYC2をターゲットに解析を進めた。前年度に単離したハナビシソウのMYC2ホモログがIQA生合成酵素遺伝子の発現制御に関わることをレポーターアッセイ系により明らかにした。また、ハナビシソウCOI1ホモログの遺伝子発現抑制株を作出し、発現レベルが20%程度まで抑制された株を複数ライン取得した。これらのCOI1発現抑制株において、IQA生合成に関わる遺伝子群の発現が低下していることをqRT-PCRにより確認した。さらに、ハナビシソウのドラフトゲノム中からJA応答性を示し、かつ植物中で安定的に発現しているJAZ遺伝子を単離した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、植物に普遍的に存在するJAシグナル伝達系のコア因子と、特化代謝制御系に特異的な制御因子群の機能解析を通じて、IQA生合成系のJAシグナル伝達に関わる制御因子ネットワークを解明し、他の特化代謝や植物プロセス（防御応答など）の制御機構と比較することでその制御ネットワークの進化や意義を明らかにするとともに、IQA生合成機構の全容解明とそれら知見を利用した代謝工学等による物質生産の可能性の検証が中心的な目的である。
2022年度は、JAシグナル伝達系のコア因子の機能解析を中心に研究を進め、ハナビシソウCOI1ホモログの発現抑制ラインの取得、MYC2ホモログの同定と機能解析、JAZ遺伝子の単離を行った。COI1抑制株については網羅的遺伝子発現解析や代謝物分析も現在進行中であり、当初の目的の1つであるJAシグナル伝達系のコア因子とIQA生合成系の遺伝子発現との関連性を分子レベルでの解明に一歩近付いたと判断した。
さらに、より直接的にIQA生合成系の制御に関わるJA応答性転写因子群の解析も並行して進めている。他の特化代謝生合成系でも関与が多く報告されているJA応答性のAP2/ERF転写因子を標的に、ハナビシソウの一過的発現系や、安定形質転換体（RNAi株や過剰発現株）を用いた解析を進めた。特に、再分化させたラインを複数取得し、これまでにほとんど解析されてこなかった植物体の組織レベルでの遺伝子発現解析や代謝物分析を実施した。以上のような成果をもとに、研究進捗状況を総合的に判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2023年度は、JAシグナル伝達系のコア因子であるCOI1-JAZ-MYC2とIQA生合成系にユニークなbHLHやその他AP2/ERFなどの転写因子群とで形成されていると予想される制御因子ネットワークの詳細をより解明していく。特に、取得したCOI1発現抑制株に加え、現在選抜中の形質転換株におけるIQA生合成遺伝子群の網羅的な発現解析と代謝物分析とを組み合わせたトランスオミクス解析や、アグロインフィルトレーションによる一過的遺伝子発現系を用いた同様の解析を進めることで、より詳細な分子機構解明が進むと考えている。
さらに、JAシグナル伝達系のコア因子複合体とIQA生合成系の転写因子群との相互作用解析（BiFC解析など）や、ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いたプロモーターに対する転写誘導活性の解析準備も進行中であり、IQA生合成酵素遺伝子の発現制御に関わるCOI1やMYC2が、IQA生合成系に特異的な制御因子の機能や発現に及ぼす影響をより直接的に明らかにすることで、より詳細な制御因子ネットワークの解明を進めていく予定である。
以上のような研究を遂行することで、本研究の中心的な目的である、IQA生合成系の遺伝子発現制御に関わるJAシグナルカスケードの詳細と進化に関する理解を深め、代謝工学的研究への応用なども検証していくことを予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2022年度に新たに取得した形質転換体の受託解析の一部に時間がかかり、年度をこえてしまうと判断したため、金額の一部を次年度にまわすこととした。
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