| 研究課題/領域番号 |
21K14974
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| 研究機関 | 大阪公立大学 |
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研究代表者 |
金城 綾二 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 特任助教 (00827941)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ネコ / iPS細胞 / bFGF / LIF / 培養条件 |
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| 研究実績の概要 |
申請者はこれまでの研究において、ヒトやイヌにおけるiPS細胞の培養条件を参考とし、ネコiPS細胞の作製時に様々な培地、添加因子、細胞外基質を組み合わせ、ネコiPS細胞の作製を試みた。その結果、高い分化能と増殖能を有するネコiPS細胞が作製可能な培養条件を明らかにした。本手法で作製したネコiPS細胞は未分化マーカー(OCT, NANOGなど)を発現し、継続的な培養を行うことが可能であった。さらにin vitroで様々な細胞に分化することが可能であった。
一方、本細胞の作製時には他種の細胞と共培養する手法（共培養系）を採用している。共培養系はiPS細胞の培養・維持に必要な様々な成長因子や細胞外基質の分泌、細胞間接着シグナルの発生などの多くの利点があり、iPS細胞の培養時に多く使用されてきた。一方、iPS細胞の分化誘導を行う際には、細胞分化には不要な成長因子や細胞外基質の分泌、細胞間接着シグナルの発生が生じてしまう。その結果、不十分な分化誘導や意図しない細胞種への分化誘導が生じるなどの欠点が考えられる。そこで、本年度は他種の細胞との共培養を必要としない、ネコiPS細胞の培養条件について検討を行った。その結果、培地や添加因子に改良を加えることにより、共培養系で作製したネコiPS細胞であっても、ネコiPS単独での維持が可能な培養条件を導き出すことに成功した。今後、本培養条件を活用することにより、不確定な要素を除外した条件下において、ネコiPS細胞の膵島細胞への分化誘導について検討することが可能となったと考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定に加え、共培養系に依存しないネコiPS細胞の培養条件の検討を行ったため、進捗状況はやや遅れていると評価する。一方、追加研究においては、培地に改良を加えることにより、共培養系に依存しないネコiPS細胞の培養条件を明らかにすることができた。本研究は以後の分化誘導研究において、不確定・不明瞭な要因を削減することに寄与するものと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
ネコiPS細胞の膵島への分化誘導・膵島の機能解析
これまでに作製したネコiPS細胞は高い増殖能と分化能を有しており、様々な細胞種への分化誘導研究に適した特性を有している。また、他の細胞種との共培養を必要としない培養条件の確立を行ったことにより、特定の細胞への分化誘導時の条件検討を行いやすくなったと考える。
本培養条件下で作製したネコiPS細胞を使用し、膵島への分化誘導について検討を行う。初期内胚葉の分化には、複数の成長因子を培養液に添加し、ネコiPS細胞を効率的に機能性の膵島に分化誘導できる各成長因子の濃度を明らかにする。膵島への分化は膵島の分化マーカー(PDX1, PAX6など)の発現、機能性タンパク質(insulin, glucagonなど)の合成などに基づいて評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
共培養細胞から様々な成長因子や細胞外基質が分泌され、ネコiPS細胞の培養・維持に貢献していると考える。一方、これらの分泌物は詳細が明らかにされているわけではなく、未知の因子が多く含まれていると考える。そのため、分化誘導の阻害、意図しない細胞種への分化誘導、培養条件の検討がしにくいなどの問題点を有する。そのため、当初の研究計画に変更を加え、共培養系に依存しないネコiPS細胞の培養条件を検討する追加研究を実施した。本追加研究の結果、共培養系に依存しないネコiPS細胞の培養条件を確立することができた。
次年度は本培養条件を活用し、ネコiPS細胞の膵島細胞への分化誘導を実施する。使用計画については、昨今の試薬代金の高騰に伴い、その補填分として活用する可能性が高いと考える。また、膵島の分化誘導についてはヒトiPS細胞で複数の手法が報告されており、これらの中からネコiPS細胞に最適な方法を検討する追加研究を計画する。
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