| 研究課題/領域番号 |
21K15007
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
黒田 杏理 滋賀医科大学, 医学部, 研修医 (80897918)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 水頭症 / Klf5 / 神経幹細胞 / 神経前駆細胞 / 神経発生 |
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| 研究実績の概要 |
水頭症は脳室に髄液が貯留して脳を圧排する病態である。胎児から小児期に生じれば脳の発達・発育が阻害され、精神・運動発達遅滞などの脳機能障害を来す。研究代表者は胎仔期の神経幹/前駆細胞で発現する遺伝子の中から、未分化性維持や増殖の制御に関わることが知られている因子であるKlf5に注目した。神経前駆細胞特異的にKlf5を過剰発現するNestinCre-Klf5マウスにおいて、胎生後期から水頭症を必発することを見出した。昨年度は、１）行動解析、２）RNA-seqを用いてKlf5の標的遺伝子の発現量の変化の解析、３）核酸類似物質を用いた細胞周期およびS期の長さの解析を行った。
１）タモキシフェン投与によって神経前駆細胞特異的にCreを発現させられるNestinCreERマウスを用い、任意のタイミングで成体脳の神経前駆細胞でKlf5を過剰発現するマウスを作製した。本モデルを用いて、空間記憶や恐怖条件付け記憶などの網羅的な行動解析を行い、行動異常の有無についてを解析した。２）神経幹細胞の未分化性維持にはNotchシグナルが重要な働きをしている。胎生15.5日齢、Klf5過剰発現マウスの脳でKlf5の標的遺伝子であるHes1やHes5などの発現をRNA-seqを用いて解析し、Hes1の発現上昇とHes5の発現低下を見出した。３）胎生15.5日齢のマウス胎仔に対して、一定の時間間隔を空けて核酸類似物質であるBrdUおよびEdUを投与(母獣に対する腹腔内投与)し、BrdU+とBrdU+EdU+細胞の比率を計測することで、細胞周期およびS期の長さを測定する予定である。先行実験として、マウス神経芽細胞腫の培養細胞であるN2a細胞を用いて細胞周期とS期の長さの解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
核酸類似物質を用いて細胞周期およびのS期長さを解析するために先行実験が必要となり、予定していたマウスの細胞を用いた実験が遅れている。しかし、細胞の染色方法や解析方法は確立されたので、今後は、マウスの神経細胞を用いた初代培養を行い解析を進める。
また、妊娠に伴う体調面の理由により実験の進行が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）行動解析を行ったマウスの脳を灌流固定し、核酸類似物質で染色することにより神経幹/前駆細胞の増減を解析する。また、神経幹細胞に直接作用して自己複製能を高める効果をもつことを研究代表者が報告したミノサイクリンや、同様の作用をもつ気分安定薬を投与し、行動異常が改善されるか否かについても検討する。
２）胎生15.5日齢、Klf5過剰発現マウスの脳を用いて神経幹細胞の自己複製能・多分化能に関わる遺伝子の発現量の変化をRT-PCR法を用いて解析する。
３）胎生15.5日齢、Klf5過剰発現マウスの脳を初代培養し、核酸類似物質を用いて細胞周期とS期の長さを解析する。また、細胞周期のフェーズによって２種類の蛍光を発するFucci2マウスをNestinCre-Klf5マウスと組み合わせ、胎生15.5日胎仔の脳スライスをタイムラプス観察することで、Klf5を過剰発現する神経前駆細胞の細胞周期を直接計測する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
旅費を申請していたが、昨年度は新型コロナウイルスが流行していたため、研究代表者が所属している施設では県をまたぐ移動を伴う学会の現地参加が推奨されず、学会はウェブ参加のみであった。本年度は可能な限り学会の現地参加を果たしたいと考えている。
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