| 研究課題/領域番号 |
21K15011
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
吉田 純子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (30769196)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 神経分化異常 / zinc finger protein / １細胞解析 / 神経デフォルトモデル / 分化抵抗性 / ES細胞 / adult neurogenesis / 順遺伝学 |
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| 研究実績の概要 |
申請者は、変異に伴いマウスES細胞の分化に異常をきたす機能未知のzinc finger protein（Zfp）遺伝子を同定し、その機能解析を進めてきた。
前回の若手研究において、質量分析により同定した本Zfp遺伝子産物と相互作用する分子の解析を進め、破壊することで本Zfp遺伝子の変異の表現型を増強させる別のZfp遺伝子を同定した。これら２つのZfp遺伝子の複合体が、未分化維持に必須の転写因子Oct4と相互作用している可能性を示唆する結果を得、相互作用を生細胞で詳細に解析するために、各Zfp遺伝子とOct4に異なる色の蛍光タンパク質をノックインすることを計画し、２つの遺伝子についてはノックインを終えた。また、1細胞RNA-seqと1細胞ATAC-seqの解析からも、本Zfp遺伝子とOct4との強い関係性が示唆された。
今回の若手研究では、上記のマウスES細胞での結果を踏まえて、ヒトiPS細胞における本Zfp遺伝子の機能を調べることを目的としている。そこで、本Zfp遺伝子のヒトのホモログであるZNF遺伝子にEGFPをノックインした株を、ゲノム編集技術を用いて作製した。しかしながら、ZNF遺伝子の発現分子数はかなり少ないとみられ、通常の蛍光顕微鏡ではEGFP標識したZNF遺伝子の振る舞いを観察することは不可能であった。今後はHalo-tagをノックインするなど可視化に関する工夫をしていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定していた、ヒトiPS細胞における本Zfp遺伝子のホモログ（ZNF遺伝子）へのEGFPのノックイン株を作製できた。しかし、通常の蛍光顕微鏡ではEGFP標識したZNF遺伝子を検出できず、ZNF遺伝子の発現分子数が想定以上に少ないものと考えられた。このため、当初の計画を変更して、Halo-tagをノックインするなどして、可視化の感度を高めることが必要となり、当初計画から若干の遅れをとっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの実験で、本Zfp遺伝子とOct4という多能性制御に重要な分子との関連性を発見した。そこで今後は、本Zfp遺伝子産物とOct4との物理的または機能的な相互作用を中心に解析を進める予定である。さらに、マウス個体やヒトiPS細胞における本Zfp遺伝子の機能も調べていきたい。
方法としては、培養細胞ではライブセルイメージングを行うとともに、Oct4および同定した２つのZfp遺伝子のHiChIP解析を行い、ES細胞が未分化状態から分化状態へと遷移する過程におけるこれらの分子の挙動と、その背後にあるゲノム三次元構造解析を行う予定である。
本Zfp遺伝子座に蛍光タンパク質をノックインしたマウスも作製済みであり、今後、特にこのマウスの脳における遺伝子発現について詳細に解析し、機能を推定していく予定である。
ヒトiPS細胞での遺伝子ホモログのノックアウト株作製の準備も進めているので、神経分化誘導時の経時的遺伝子発現の推移を調べ、マウスでの遺伝子ネットワークと比較することで機能解析を進めていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和３年度は、ヒトiPS細胞における本Zfp遺伝子の機能を調べることを目的とし、本Zfp遺伝子のヒトのホモログであるZNF遺伝子にEGFPをノックインする株を作製することを試みた。しかしながら、蛍光顕微鏡でEGFP標識したZNF遺伝子を検出することができなかったため、ノックインを複数回試みた。そのため当初の計画より遅れが生じた。
また、Oct4という重要な分子との関連性を発見できたため、当初の研究計画を変更し、HiChIP解析という高額の消耗品費およびシーケンス受託解析費を必要とする解析によって、分子メカニズムを調べることになった。令和３年度使用予定であった額と次年度分を合わせた金額で、次年度にHiChIP解析を行う予定である。
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