| 研究課題/領域番号 |
21K15049
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
早乙女 友規 長岡技術科学大学, 工学研究科, 助教 (40867610)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 高温でのRO形成 / DSC測定 / 一残基置換 / アミロイド線維 |
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| 研究実績の概要 |
令和3年度は1種類の小型球状蛋白質（PSD95-PDZ3）において、一残基置換による変異体設計（8種類）が完了し、DSC装置を用いた熱測定、ThT・ANS蛍光を用いた分光学的測定、電子顕微鏡による観察など様々な物性測定を実施した。その結果、2種類の変異体（F340AおよびL342A）で高温でのRO形成を阻害でき、さらにアミロイド線維も効果的に抑制することができた。したがってPDZ3において高温でのRO形成はアミロイド線維の前駆体である可能性が示唆され、たった一残基のアミノ酸を置換するだけで熱凝集の傾向性を大幅に低下させることができた。この研究成果は、国内学会発表2件、査読付き英語論文1報で発表済みである。
さらに同じ小型球状蛋白質を用いて、これまでとは逆に親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸へと一残基置換することで、リバースエンジニアリングによる変異体（3種類）を設計した。その結果、1種類の変異体で高温でのRO形成が人工的に促進され、アミロイド線維も有意に成長していると分かった。これらの結果は、高温でのRO形成にはオリゴマー接触面に存在する疎水性残基が重要であるという仮説を裏付けるものであり、形成メカニズムに関する新たな手掛かりが得られた。この研究成果は、国内学会発表1件で発表済みであり、現在は英語論文として海外の査読付き雑誌に投稿中である。
また上記の一残基置換による変異体では、基本的に高温でのRO形成のみを制御しており、天然状態での二次構造・熱安定性・会合状態など他の物性には殆ど影響していない。ゆえに蛋白質の熱凝集傾向性のみを低下できる分子設計法の開発に大きく役立つと期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1種類の小型球状蛋白質（PSD95-PDZ3）に関して、第1段階の「一残基置換による変異体設計と高温でのRO形成の阻害」および第2段階の「高温でのRO形成の阻害によるアミロイド線維の抑制」を実験的に証明することができ、あらかじめ設定していた研究実施計画の第2段階まで完了したとみなせる。もともと第1段階は1年目の前半6か月、第2段階は1年目の後半6か月で進めていく予定であったことから、本研究は当初の計画通りに進んでいると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度は研究実施計画の第3段階である「一残基置換による分子設計法の汎用性の向上」に着手していく予定である。具体的には、他の種類の小型球状蛋白質をモデルとし、PSD95-PDZ3と同様に一残基置換による変異体を設計し、高温でのRO形成およびアミロイド線維を抑制できるか検証していく。モデル蛋白質の候補として、デングウイルス由来エンベロープ蛋白質第3ドメイン（DEN ED3）が挙げられ、すでに疎水性アミノ酸の一残基置換で高温でのRO形成を阻害できることを確認している。今後はアミロイド線維形成について物性測定を行い、アミロイド線維の抑制にも十分な効果が得られるか調べていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究で蛋白質の物性測定を行うにあたって、申請者が所属する研究室の主宰者である城所俊一教授が、実験で使用する消耗品や生化学試薬などの大部分を代わりに購入した。そのため令和3年度の申請者の支出は最小限で済み、残りの金額は令和4年度以降の次年度使用額として繰越すことになった。そして令和4年度分として請求した助成金と合わせて、組換え蛋白質の物性測定に必要な消耗品および生化学試薬の購入、および学会発表の参加費や学術雑誌への論文投稿料に充てようと考えている。特に令和4年度では前年度と比較して研究の進捗ペースが上がると予想され、より多くの経費を用意する必要がある。
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