| 研究課題/領域番号 |
21K15051
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
守島 健 京都大学, 複合原子力科学研究所, 助教 (40812087)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 時計タンパク質 / X線小角散乱 / 中性子小角散乱 / 超遠心分析 / AUC-SAS |
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| 研究実績の概要 |
Kai時計タンパク質の周期的なリン酸化・脱リン酸化の概日振動の制御機構を紐解くためには、3種類のKaiタンパク質（KaiA, KaiB, KaiC）が形成する複合体の形成メカニズムや構造についての理解が必要である。本研究では特に、リン酸化が亢進する際に形成するKaiA-KaiC複合体（AC複合体）に注目し、その溶液中での構造を解明することを目的としている。これまで、KaiA-KaiC間の非常に速い結合解離に起因した単離精製の困難さや、溶液中でのフレキシブルな形態変化により、結晶構造解析や電子顕微鏡法によるAC複合体の構造解析は困難であった。そこで本研究では超遠心分析（AUC）とX線及び中性子小角散乱（SAXS及びSANS、総称してSAS）を組み合わせたAUC-SAS法を駆使して、多成分溶液中でのAC複合体のみに由来した散乱データを選択的に取得し、構造解析を行っている。さらに、KaiAあるいはKaiCの重水素化ラベルを用いたSANS測定により、複合体の一部を散乱データ上で不可視化して、AC複合体の部分構造を解明し、AC複合体がリン酸化を亢進するメカニズムの詳細に迫ることを目指している。
初年度は、非変性質量分析（Native-MS）とAUCによるAC複合体の形成条件検討を詳細に行い、会合数の化学量論比や解離定数を明らかにした。得られた知見をもとに、SAXS測定で得られた散乱データを、AUC-SAXS法を用いて成分分離し、AC複合体のみに由来するSAXSプロファイルを取得することに成功した。これをもとに、AC複合体の全体構造およびダイナミクスの解析を遂行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度は、まず、KaiAとKaiCの形成するAC複合体の形成条件の検討を、非変性質量分析（Native-MS）と超遠心分析（AUC）を用いて行った。KaiCの様々なリン酸化状態を模した変異体を利用して実験を行った結果、リン酸化状態に応じた会合数の化学量論比や解離定数を解明することができた。この知見は、Kaiタンパク質系におけるリン酸化・脱リン酸化の制御機構を理解するために大変重要なものである。続いて、上記の知見をもとに、SAXS測定で得られた散乱データを、AUC-SAXS法を用いて成分分離し、AC複合体のみに由来するSAXSプロファイルを取得することに成功した。得られた散乱プロファイルから、AC複合体全体の構造の解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度は、上記で得られたAC複合体のみに由来するSAXSプロファイルを再現する構造集団を分子動力学シミュレーションを用いて探索し、溶液中でのより詳細な構造やダイナミクスの解明を目指す。続いて、AC複合体の部分構造情報の取得を目指した重水素化支援中性子散乱散乱（DA-SANS）測定のための、KaiA及びKaiCの重水素化試料作成の検討を行う。作成した試料については、質量分析と赤外分光法による試料品質の検討を行い、溶媒組成の微調整による厳密なコントラストマッチングを実現することで、詳細な構造の議論を可能にする精緻なSANSプロファイルの取得を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID-19による影響で海外での中性子小角散乱実験が延期となり、重水素化ラベル試料の作成に必要な試薬の購入が後ろ倒しとなっているため。これらの試薬は2022年度購入し、重水素化ラベル試料の作成に着手する。（ただし、中性子小角散乱にかわりに、所属機関で遂行可能な質量分析、超遠心分析、X線小角散乱を用いた研究を進めることができたため、全体として研究計画の遅れは無い。）
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