2022 年度実施状況報告書

陸上植物に共通するオーキシン-WIP経路の多面的な発生制御の原理を探る

研究課題

研究課題/領域番号	21K15125
研究機関	愛媛大学
研究代表者	加藤大貴愛媛大学, 理工学研究科(理学系), 助教 (30846994)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	ゼニゴケ / ホルモン / シグナル伝達 / 進化
研究実績の概要	本研究ではゼニゴケをモデルに（１）WIPの標的遺伝子の網羅的探索と結合配列の推定、（２）生化学的・遺伝学的アプローチによるWIPと相互作用するタンパク質の探索、（３）組織特異的な複合体形成による下流応答制御の検証を計画しており、本年度は（１）、（２）について以下のような成果を得た。（１）クロマチン免疫沈降シーケンス解析（ChIP-seq）を行うために、昨年度はエストロゲン依存的にGFPタグを融合したWIPタンパク質を発現する株の作成を試みた。しかしエストロゲン処理により表現型を示す株が得られず、GFPタグがWIPの機能を阻害している可能性が考えられた。そこで本年度はタグをGFPよりも分子量が小さく機能阻害を起こしにくいと予想される3xFLAGに変更し、ゼニゴケへの形質転換を行った。その結果、エストロゲンによりWIP遺伝子の転写誘導と発生異常を示す株を得ることができた。また昨年度までに行ったWIPの過剰発現株と機能欠損変異体を用いたRNA-seq解析のデータを用いて、WIPによって発現が変動する遺伝子のプロモーター解析をおこなった。結果の一部についてはシロイヌナズナでの先行研究（Roldan et al., 2020）と一貫しており、WIPの機能に進化的な保存性があることが示唆された。（２）WIPが相互作用因子と協同して機能する場合、両者は同じ細胞で発現している必要がある。そこで既存のRNA-seqデータを集めたゼニゴケの遺伝子発現データベース（MarpolBaseExpression）を用い、WIP遺伝子と発現パターンが類似した遺伝子の探索を行った。その結果、WIPの上流で働くと考えられるARF1の他に７種類の転写因子が同定された。上記に加え、WIPの上流で働くオーキシン受容体の機能解析について京都大学の河内孝之教授、東京理科大学の西浜竜一教授のグループと共同研究を行い、その成果についてPlant Cell誌において論文発表を行った。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由研究代表者は2022年3月に愛媛大学理工学研究科に移動し、独自の研究グループを立ち上げることになった。ゼニゴケを培養するための設備など、研究環境を新たに整備しなければならなかったこと、また教育・運営業務が増加したことにより、研究計画の実行以外にかかる時間と経費が増加したことが進捗の遅れを生じさせた。
今後の研究の推進方策	本研究の計画は大きく（１）WIPの標的遺伝子の網羅的探索、（２）WIPの相互作用因子の探索、（３）組織特異的な複合体形成の検証に分けられる。（３）は（１）、（２）の成果を前提としており、次年度は主に（１）、（２）について以下のような方策で研究を遂行する。（１）WIPの標的遺伝子・結合配列を同定するため、本年度に作成したエストロゲン依存的に3xFALGタグ融合WIPを発現する株（XVE>>WIP-FLAG）を用いてChIP-seq解析を行う。その際、過去に行った機能欠損変異体および過剰発現株を用いたRNA-seq解析と発現変動遺伝子のプロモーター解析のデータを参考にする。（２）XVE>>WIP-FLAG株を用いて免疫沈降-質量分析法方による相互作用同定を試みる。本年度の成果により同定されたWIPと共発現する転写因子や、（１）で同定したWIP結合配列の情報を合わせて相互作用因子候補を同定する。得られた候補因子については、Y2H法やBimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)法によりWIPとのタンパク質相互作用の検証を行う。（３）上記の計画によりWIPの標的遺伝子、結合配列、相互作用因子が同定されていれば、相互作用因子の発現組織解析や機能欠損変異体の作成を行う。
次年度使用額が生じた理由	本年度までの使用額が計画に比べて少なかった理由として大きく2つ挙げられる。１つは研究代表者の機関移動による研究計画の遅れと変更である。もう１つは旅費が想定より少なくなったことである。新型コロナウイルスの問題が継続していることから本年度は研究代表者が参加を予定していた国内外の学会はオンライン形式、または対面とオンラインを併用したハイブリット形式で開催された。国または所属機関における出張後の外出制限による弊害を鑑み、本年度は学会への対面参加を控えたため旅費の使用が少なくなった。次年度では変更した研究計画に沿って、各種消耗品や少額機器の購入、質量分析や次世代シーケンサーなどの受託解析、共同利用機器の使用料として使用する。また国内外研究者からフィードバックを得るための学会参加費、国際誌における論文発表のための投稿料や英文校閲の謝金として使用する。