| 研究課題/領域番号 |
21K15125
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
加藤 大貴 愛媛大学, 理工学研究科(理学系), 助教 (30846994)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ゼニゴケ / ホルモン / シグナル伝達 / 進化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではゼニゴケをモデルに（１）WIPの標的遺伝子の網羅的探索と結合配列の推定、（２）生化学的・遺伝学的アプローチによるWIPと相互作用するタンパク質の探索、（３）組織特異的な複合体形成による下流応答制御の検証を計画しており、本年度は（１）、（２）について以下のような成果を得た。
これまでに計画（１）に必要なクロマチン免疫沈降シーケンス解析（ChIP-seq）、および計画（２）に必要な共免疫沈降-質量分析を行うために、エストロゲン依存的にGFPタグを融合したWIPタンパク質を発現する株の作成を試みていた。しかしエストロゲン処理により表現型を示す株が得られず、GFPタグがWIPの機能を阻害している可能性が考えられた。そこで昨年度にタグをGFPよりも分子量が小さく機能阻害を起こしにくいと予想される3xFLAGに変更してゼニゴケへの形質転換を行い、エストロゲンによりWIP遺伝子の転写誘導と発生異常を示す株を得ることができた。しかし形質転換体を１株しか得られておらず遺伝学的解析には不十分であったため、今年度に再度ゼニゴケへの形質転換を行い、エストロゲンによりタグなしWIPタンパク質過剰発現株と同様の表現型を示す株を合計で３株取得することができた。また得られた株からタンパク質抽出を行い、抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロッティングによるWIP-3xFLAGタンパク質の検出を試みたところ、エストロゲン誘導後にWIP-3xFLAGと推定される分子量の位置のバンドを検出することができた。この結果からWIP-3xFLAGタンパク質を発現株する株の確立に成功したと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究指導を行う学生、担当する授業科目や学内委員会の数が前年度と比べて増加したことにより、本研究の遂行に費やせる時間が減少し、当初の計画通りに実験を行うことができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の計画は大きく（１）WIPの標的遺伝子の網羅的探索、（２）WIPの相互作用因子の探索、（３）組織特異的な複合体形成の検証に分けられる。しかし（３）は（１）、（２）の成果を前提としているため、次年度は（１）、（２）に注力し以下のような方策で研究を遂行する。
（１）WIPの標的遺伝子・結合配列を同定するため、本年度に作成したエストロゲン依存的に3xFALGタグ融合WIPを発現する株（XVE>>WIP-FLAG）を用いてChIP-seq解析を行う。その際、過去に行った機能欠損変異体および過剰発現株を用いたRNA-seq解析と発現変動遺伝子のプロモーター解析のデータを参考にする。
（２）XVE>>WIP-FLAG株を用いて免疫沈降-質量分析法方による相互作用同定を試みる。これまでの解析により同定されたWIPと共発現する転写因子や、（１）で同定したWIP結合配列の情報を合わせて相互作用因子候補を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度までの使用額が計画に比べて少なかった理由として大きく2つ挙げられる。１つは研究代表者の機関移動や教育・管理運営業務の増加による研究計画の遅れと変更である。もう１つは新型コロナウイルスの問題による旅費使用の減少である。研究代表者が参加を予定していた多くの国内外の学会がオンライン形式、または対面とオンラインを併用したハイブリット形式で開催された。国または所属機関における出張後の外出制限による弊害やオンラインの利便性を鑑み、特に昨年度までにおいて学会への対面参加を控えたため旅費の使用が少なくなった。
次年度では変更した研究計画に沿って、各種消耗品や少額機器の購入、質量分析や次世代シーケンサーなどの受託解析、共同利用機器の使用料として使用する。また国内外研究者からフィードバックを得るための学会参加費、国際誌における論文発表のための投稿料や英文校閲の謝金として使用する。
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