| 研究課題/領域番号 |
21K15196
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| 研究機関 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所) |
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研究代表者 |
瀧川 健司 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 主任研究員 (60749274)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | GABA / 蛍光プローブ / シナプス |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、シナプス前部から開口放出されるGABAを単一シナプスレベルで可視化するGABA蛍光イメージング技術を開発し、GABAの開口放出制御機構を明らかにすることを目的とする。本年度では、単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングに適用可能なGABA蛍光プローブの開発に取り組んだ。本研究課題で開発する蛍光プローブは、リガンド結合タンパク質と低分子蛍光色素の複合体で構成されるハイブリッド型プローブであり、リガンドの結合に伴って蛍光強度が変化する仕組みを有する。ハイブリッド型プローブは、システイン点変異を導入した組換えタンパク質を大腸菌発現系にて取得し、チオール基と特異的に反応する環境感受性蛍光色素を標識することで作製した。直径1 μmにも満たない微小なシナプス前部から開口放出される微量のGABAを単一シナプスレベルで可視化するためには、高い輝度と光退色耐性に加えて、GABAの結合に伴って非常に大きな蛍光強度変化を示す蛍光プローブが必要である。このような性能を有したハイブリッド型プローブを開発するためには、リガンド結合タンパク質上に標識する蛍光色素の最適な位置を探索することが有効であることを、研究代表者らは以前の研究で見いだしている。そこで、多数のシステイン点変異体と蛍光色素の組み合わせを効率的に評価するために、蛍光複合体の作製からGABAに対する応答性評価までの一連の工程を96穴プレートベースで行うHyFInDスクリーニングシステムの条件最適化を行った。次に、HyFInDスクリーニングのパイロット試験を3種類のシステイン点変異体を用いて行った。その結果、全てのシステイン点変異体についてタンパク質が高純度に精製され、蛍光色素が標識された光複合体が作製されていることをSDS-PAGEで確認することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度に計画していた単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングに適用可能なGABA蛍光プローブの開発を順調に進めることができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
HyFInDスクリーニングシステムを用いて多数のシステイン点変異体と蛍光色素の組み合わせを効率的に評価し、GABAの結合に伴って大きな蛍光強度変化を示す蛍光プローブ候補を取得する。また、蛍光プローブ候補のGABAに対する親和性や選択性を評価して、単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングへの応用に有望なGABA蛍光プローブを選定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
蛍光プローブを開発するために購入を予定していた一部の試薬や消耗品については、蛍光プローブ作製のスモールスケール化に成功し、購入を見送ったため。次年度に繰り越した額は、HyFInDスクリーニングでのシステイン点変異体と蛍光色素の組み合わせを充実させるために、蛍光色素やプラスチック製品などの消耗品の購入に使用する計画である。
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