研究課題
リサイトは毛細血管を被覆する壁細胞であり，通常時安定な血管構造維持に寄与していると考えられている．一方で，組織が傷害など損傷を受けると，損傷部位が虚血となりこれを解消するために血管新生が誘導される．血管新生は既存血管から新たな血管を形成する現象で，創傷治癒時など生理的条件下では生体の恒常性維持に寄与する．一方，がんなどの病態時では，血管新生による異常血管形成が病態を悪化させることが知られている．血管新生が生体へ相反する作用を有する機構は未だ不明のままであるが，病的血管新生ではペリサイトによる被覆が少ないことが特徴の１つであり，ペリサイトの機能が生理的血管新生に重要であると考えられている．しかしながら血管新生におけるペリサイトの役割は未だ不明のままである．そこで申請者らは，血管新生過程におけるペリサイトの役割を明らかとするため，1年目で任意のタイミングでペリサイトを除去できるゼブラフィッシュを樹立し，アブレーションの条件を確立した．さらに，成魚皮膚血管をライブで観察するイメージング手法を確立した．そこで２年目では，ペリサイトをなくした後に血管新生を誘導し，その影響を解析した．その結果，ペリサイトをなくした後に血管新生を誘導すると，内皮細胞の過剰な出芽と伸長方向の異常が観察された．以上のことから，ペリサイトは血管新生を積極的に制御することが示唆された．そこで，その制御メカニズムを明らかとするために，皮膚組織から内皮細胞を採取し，トランスクリプトーム解析を実施することにした．現在，ゼブラフィッシュ皮膚組織から内皮細胞をFACSにより採取する条件検討を行なっている．
3: やや遅れている
２年目では，まずペリサイトをなくした際の血管新生過程をライブで観察したデータを詳細に解析してきた．その結果，ペリサイトがないと内皮細胞の出芽が増加し，血管枝の伸長方向が異常となり，最終的に血管長が増加した．そこで，内皮細胞の増殖能にも影響がある可能性を考え，EdUにより増殖細胞をラベルし解析を行なった．その結果，ペリサイトをなくすとEdU陽性の内皮細胞が増加し，ペリサイトが内皮細胞の増殖能を制御することが示唆された．また，ライブイメージングにより観察されたこれらの現象が如何にして制御されているかを明らかとするために，成魚皮膚から内皮細胞を単離し，トランスクリプトーム解析を実施する実験系の確立に着手した．まず，成体ゼブラフィッシュの皮膚組織から内皮細胞をFACSにて単離するために，組織分散条件及びセルソーティングの検討を行なってきた．まだ条件検討の段階であるが，皮膚組織の分散条件が概ね確立してきている．また，この実験を実施するために多数のゼブラフィッシュを用意する必要があり，繁殖及び飼育を継続的に実施している．また，病的血管新生におけるペリサイトの役割を知るために，免疫不全ゼブラフィッシュで内皮細胞及びペリサイトを可視化した魚を樹立した．この魚へ腫瘍を移植する実験を実施してきたが，腫瘍細胞の移植条件に苦戦しており，実験条件のさらなる検討を重ねている．
3年目では，ライブイメージングにより明らかとなった生理的血管新生過程におけるペリサイトの役割について論文としてまとめる．さらに，ペリサイトによる血管維持機構を理解するために，成魚皮膚からの内皮細胞の単離条件を確立し，トランスクリプトーム解析の実験系を確立する．ペリサイトをなくした個体から内皮細胞を採取し，正常個体の遺伝子発現と比較することで，ペリサイトが如何にして血管機能を維持しているかについて候補となる分子やパスウェイを同定する．さらに，重要と思われる遺伝子や分子を選定し，これらの機能を阻害するノックアウトフィッシュ及びトランスジェニックフィッシュを作成する．この遺伝子改変フィッシュを用い，着目した遺伝子や分子がペリサイトによる血管機能に重要であるか検証実験を行う．さらに，病的血管新生モデルの確立についても検討を進めていく．免疫不全ゼブラフィッシュへの腫瘍細胞の移植条件が未確立であるが，条件の確立を目指す．
FACSによる細胞単離の条件検討が思うように進まず，トランスクリプトーム解析のための予算を執行できなかった． 昨年度の実験経験から， 大方の目処をつけることができたので，今年度は計画通りNGSデータ解析を実施する予定である．
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The Journal of Biochemistry
巻: 174 ページ: 5～12
10.1093/jb/mvad024
Nature Communications
巻: 13 ページ: 2594
10.1038/s41467-022-30197-8
