自己増幅型RNAとナノ脂質粒子DDSを用いた軟骨無形性症治療法開発研究

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K15350
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 家崎 高志 愛知医科大学, 医学部, 助教 (30784285)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 自己増幅型RNA / 遺伝子疾患 / 核酸医薬

研究実績の概要

申請者はこれまでに軟骨組織に対する新たな遺伝子治療法を探索し、自己増幅型RNA(saRNA)とナノ脂質粒子遺伝子導入法を用いたマウス軟骨組織への遺伝子導入法を世界に先駆けて成功した。そこで本研究課題では、①自己増幅型RNAを用いた骨組織への遺伝子発現制御法の確立を行い、②自己増幅型RNAを用いた遺伝性骨疾患の治療法開発研究を行う。その成果を、自己増幅型RNAを用いた治療薬開発のための研究基盤とする。
本年度は申請者の所属研究機関を変更したこともあり、これまで使用していた研究試料の一部は使用が難しくなった。そのため、研究対象とする変異型遺伝子を従来のFGFR3遺伝子から、もう一つ予定していた進行性骨化性線維異形成症（FOP）の原因遺伝子であるACVR1変異遺伝子へと変更することとした。
本年度はまず、変異型ACVR1ノックダウン用RNAの設計とACVR1遺伝子変異筋芽細胞への効果を検討した。FOP患者の原因遺伝子であるACVR1R206H点変異のみを抑制するsaRNAを設計ソフトにより作製した。
設計したsaRNAをACVR1R206H変異を導入したC2C12筋芽細胞に導入し、導入細胞のタンパク質を回収し、変異型ACVR1のみがノックダウンされるか検討した。変異型ACVR1ノックダウン用saRNAをACVR1R206H変異型C2C12細胞に導入した結果、変異型ACVR1のみが有意に発現低下し、野生型ACVR1の発現は有意な変化は認められなかった。また、変異型ACVR1ノックダウン用saRNAを導入したACVR1R206H変異型C2C12細胞を軟骨細胞へ分化させた結果、変異型ACVR1ノックダウン用saRNAを導入した細胞では軟骨細胞への分化が抑制されたいた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

申請者自身の自己都合により、昨年度から別の研究機関へ移動することになった。その際に、使用を予定していた遺伝子改変マウスなどが使用できない状態が続いていたため、研究対象とする遺伝子をFGFR3から、別に予定していたACVR1へと変更した。そのため変異型ACVR1遺伝子を抑制するsaRNAを新たに設計することから始めたため、当初の予定から遅れている状況である。
研究の要となる変異型ACVR1遺伝子を抑制するsaRNAを設計し、それを利用して変異型ACVR1遺伝子の発現を抑制し、C2C12細胞の軟骨細胞への分化を抑制することができたが、研究状況の遅れを鑑みて、本研究課題の進行状況を(3)と判断した。

今後の研究の推進方策

ACVR1 R206H変異導入C2C12細胞にsaRNAを導入することで、変異遺伝子の発現を抑制し、軟骨細胞への分化を抑制することができたため、今後はFOP患者由来ヒトiPS細胞をRIKEN BRCから入手し、iPS細胞にノックダウン用saRNAが導入可能か検討する。また、導入したiPS細胞の軟骨細胞への分化がマウスの細胞と同様に回復するか検討する。
また、ACVR1 R206H TgマウスにsaRNAを導入し、骨の異常形成の表現型が回復するか検討する予定である。

次年度使用額が生じた理由

昨年度は別の研究機関へ移動があったため、研究計画が予定よりも遅れているため、研究費の使用も予定よりも少なくなった。また研究機関の変更に伴い、当初、使用を予定していた遺伝子改変マウスの使用が難しくなり、移動後の研究機関で新たに遺伝子改変マウスの入手を計画している。その遺伝子改変マウスの入手のために、予定よりも多くの予算使用を計画している。
そのため、当初予定していた今年度の実験用動物費300000円に加えて、次年度使用額分を実験動物の購入、飼育費に充てることを計画している。

研究成果

• [雑誌論文] l-Type amino acid transporter 1 in hypothalamic neurons in mice maintains energy and bone homeostasis (2023)
  • 著者名/発表者名: Park G, Fukasawa K, Horie T, Masuo Y, Inaba Y, Tatsuno T, Yamada T, Tokumura K, Iwahashi S, Iezaki T, Kaneda K, Kato Y, Ishigaki Y, Mieda M, Tanaka T, Ogawa K, Ochi H, Sato S, Shi Y-B, Inoue H, Lee H, Hinoi E
  • 雑誌名: JCI Insight 巻: 8 ページ: -
  • DOI: 10.1172/jci.insight.154925
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The role of CDK8 in mesenchymal stem cells in controlling osteoclastogenesis and bone homeostasis (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamada Takanori、Fukasawa Kazuya、Horie Tetsuhiro、Kadota Takuya、Lyu Jiajun、Tokumura Kazuya、Ochiai Shinsuke、Iwahashi Sayuki、Suzuki Akane、Park Gyujin、Ueda Rie、Yamamoto Megumi、Kitao Tatsuya、Shirahase Hiroaki、Ochi Hiroki、Sato Shingo、Iezaki Takashi、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 17 ページ: 1576～1588
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2022.06.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The L-type Amino Acid Transporter (LAT1) Expression in Patients with Scoliosis (2022)
  • 著者名/発表者名: Demura Satoru、Hinoi Eiichi、Kawakami Noriaki、Handa Makoto、Yokogawa Noriaki、Hiraiwa Manami、Kato Satoshi、Shinmura Kazuya、Shimizu Takaki、Oku Norihiro、Annen Ryohei、Kobayashi Motoya、Yamada Yohei、Nagatani Satoshi、Iezaki Takashi、Taniguchi Yuki、Tsuchiya Hiroyuki
  • 雑誌名: Spine Surgery and Related Research 巻: 6 ページ: 402～407
  • DOI: 10.22603/ssrr.2021-0189
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Conditional inactivation of the L‐type amino acid transporter LAT1 in chondrocytes models idiopathic scoliosis in mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Iwahashi Sayuki、Lyu Jiajun、Tokumura Kazuya、Osumi Ryoma、Hiraiwa Manami、Kubo Takuya、Horie Tetsuhiro、Demura Satoru、Kawakami Noriaki、Saito Taku、Park Gyujin、Fukasawa Kazuya、Iezaki Takashi、Suzuki Akane、Tomizawa Akane、Ochi Hiroki、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: Journal of Cellular Physiology 巻: 237 ページ: 4292～4302
  • DOI: 10.1002/jcp.30883
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 自己増幅型RNAを用いた新規遺伝子治療法の開発研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 家﨑 高志、佐藤 元彦
  • 学会等名: 第69回中部日本生理学会
• [備考] 愛知医科大学 医学部 生理学講座
  • URL: http://www.aichi-med-u.ac.jp/physio2/
• [備考] 愛知医科大学 生理学講座
  • URL: https://www.aichi-med-u.ac.jp/su06/su0607/su060702/02.html