| 研究課題/領域番号 |
21K15414
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
大西 威一郎 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (70750214)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 骨髄間葉幹細胞株 / 脱細胞化骨 / CRISPR library |
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| 研究実績の概要 |
2022年度は、ヒト骨髄間葉幹細胞株UE7T-9細胞の脱細胞化骨への進展因子として、CRISPR activation library(SAM library))で同定したSHC4について、SHC4過剰発現細胞株のRNA sequence 解析を施行し、Cell motilityに関する因子の発現亢進を得た。この成果については、Bioengineering誌に報告した。
CRISPR knock out library(GeCKO v2 library)で同定したSRRM4については、SRRM4 Knock out(KO) UE7T-9細胞株をCRISPR lenti v2にて作成し、限界希 釈からのcloningを行なった。完全なKO細胞株は樹立できなかったものの、部分的なKOは確認できた細胞株を樹立した。増殖能の評価(MTS assay), 移動能の評価(Scratch assay)、足場非依存性(Soft agar assay)を行ない、SRRM4KO細胞株では、対照群と比較して、増殖能には変化が なかったが、移動能の亢進と、足場非依存性の増殖が認められた。また脱細胞化骨への進展も、確認された。RNA sequence 解析では、Extracellular matrixやCytokine activityに関する因子の発現亢進を得た。SRRM4に関する結果についても、論文投稿の準備を進めている。
2022年度は、上記樹立細胞株の、脱細胞化骨への進展、生着率が著明に低下しており、細胞のcloningなどをやり直ししたが、生着率の改善に乏しかった。その原因として、2022年度に使用した脱細胞化骨について、生理食塩水下で長期保存により、品質として劣化した可能性が考えられる。今後は用いる脱細胞化骨の都度作製なども検討する。また、マウス皮下への移植も進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
脱細胞化骨への進展、生着率が著明に低下しており、細胞のcloningなどをやり直したため。また、脱細胞化骨について、保存による劣化や都度作製についても、再検討する必要が生じたため。
マウスへの皮下移植実験も行ったが、マウスの造血環境構築には、月単位の経過観察が必要なことが判明したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
脱細胞化骨への進展、生着率の改善を求むべく、脱細胞化骨について都度作製の方針とする。
マウス皮下にて、UE7T-9細胞の生着が認められれば、 DICER1KO細胞株も作成し、造血細胞の異形成や腫瘍化誘導の有無を確認していきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
脱細胞化骨への進展、生着率が著明に低下しており、細胞のcloningなどをやり直したため。また、脱細胞化骨について、品質劣化や都度作製について、再検討する必要が生じたため。
マウスへの皮下移植実験も行ったが、マウスの造血環境構築には、月単位の経過観察が必要なことが判明したため。
以上の理由により、研究期間の延長を申請した。
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