|
まず、ヒトIGF1の遺伝子配列をCH2CH3.28ζの第2世代CAR-Tに組み込み発現を評価したところ、培養期間中に経時的にCAR発現率が低下することが明らかとなった。そこで、mature IGF1の翻訳過程に着目し、N末端にSignal peptide(pre peptide)とC末端にE-peptide(pro peptide)をを持つimmature IGF1をCARとして発現させたところ、安定したCAR発現率が得られた。これをpreliminaryの評価としてIGF1Rを発現するTHP-1と共培養させたところ、安定した抗腫瘍効果が得られた。また、比較検証の結果、Pre peptideを有するPre IGF1が最も高い抗腫瘍効果を示した。IGF1は血中で6種類のIGFBPと結合することで血中での維持を可能にしている。このIGFBPはIGF1のIGF1Rに対する親和性を低下させることが知られており、このpre IGF1もin vivoではIGFBPと結合し抗腫瘍効果が低下する可能性が考えられた。そこで、IGFBPに対する親和性が100分の1まで低下することが知られる、ヒト脳で見られる変異体であるDes1-3 IGF1に注目し、Pre Des1-3IGF1を抗原認識部位とし、recombinant IGF1Rタンパクによる固相化抗原刺激試験を、IGFBPタンパクの有無でサイトカインの産生量を比較したところ、pre IGF1ではIGFBPとの結合によってIGF1Rとの反応がみられなくなった一方で、Pre Des1-3 IGF1はIGFBPによる親和性低下が軽減された。IGF1-IGFBP2量体はALSタンパクと3量体を形成することが知られており、これを完全に防ぐために、複数のアミノ酸変異pre IGF1の比較実験の結果、Pre AA fixed IGF1の開発に成功した。
|
