2021 年度実施状況報告書

抗腫瘍免疫におけるNK細胞と好中球細胞外トラップの相互作用に関する検討

研究課題

研究課題/領域番号	21K15651
研究機関	京都府立医科大学
研究代表者	土井俊文京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60800985)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	好中球細胞外トラップ / NK細胞
研究実績の概要	ヒト白血病細胞株HL-60を2μMのAtRA (All-trans retinoic acid)で誘導した好中球様細胞株や、健常人ボランティアから採取した末梢血好中球(peripheral blood neutrophil: PBN) にPMA(phorbol myristate acetate)刺激を行い、好中球細胞外トラップ(neutrophil extracellular traps: NETs)の生成を行った。NETsの生成は蛍光顕微鏡で確認した他、dsDNA量を測定することで定量化も行った。NETs誘導にはDMSOも使用し、PMAとの比較を行った。PMA刺激によるNETs形成が再現性を持って確認出来、手法が確立してきていることから、今後のNK細胞機能に関する実験への基盤が整った状況である。まずは、KHYG1などのNK細胞株を用いてNK細胞機能の検討を開始する予定である。また、動物モデルも同時に進めており、C57BL/6マウスの足底に悪性黒色腫細胞株（B16BL6）を移植した後に、下肢を切断することで肺への自然転移を起こるモデルを使用し、自然転移に対するNETsの関連を検討するため、NETs形成を阻害するDNAseⅠを投与し、肺でのNETs形成の差異や、肺転移個数の変化を検討した。DNAseⅠ投与群で、転移やNETs形成が抑制される傾向は認めており、今後再現性を含め検討を重ねる予定としている。また、膵癌細胞株（Pan02）の膵臓への同所移植による肝転移モデルも作成を開始しており、現在は条件設定を行っている。悪性黒色腫細胞株の肺転移モデルと併用して、転移に対するNETsの影響を検討する予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由細胞株による実験では、投与試薬の濃度設定などの条件設定の確立に時間を要した。また、マウスに対する実験モデルは確立されており、そのモデルを用い、臓器や血液の解析を行っているが、昨年度はコロナ禍に伴う実験禁止期間があり、予定よりはやや遅れていると思われる。
今後の研究の推進方策	in vitroモデルでのNETs形成がほぼ確立してきており、今後はNK細胞機能に対するNETsの影響を検討していく。具体的にはNETsによるNK細胞の捕捉能や、NK細胞の細胞障害活性に対する影響を検討する。また、マウスモデルにおいても、悪性黒色腫細胞株肺転移モデルの他、膵臓癌細胞株の肝転移モデルも作成、転移に対するNETsの影響を検討する。
次年度使用額が生じた理由	in vitroのNETs生成実験で条件設定に時間を要したこと、マウスモデルの実験がコロナ禍で進まなかったことから、昨年度に予定していたNK細胞機能とNETsの関連の研究、マウスモデルの解析を次年度に行うため、研究費用を繰り越した。また、WEB参加となった学会出張費も次年度に繰越した。