| 研究課題/領域番号 |
21K15913
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター |
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研究代表者 |
三浦 茜 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, (非)研究員 (40795449)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2027-03-31
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| キーワード | 遺伝子治療 / アンジェルマン症候群 / UBE3A-ATS転写抑制 / CRISPR/dCas9 / AAV5 |
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| 研究実績の概要 |
アンジェルマン症候群はUbe3a遺伝子の欠失や変異による機能障害から引き起こされる。本研究では、dCas9-KREB-MeCPsによるUBE3A-ATS領域の転写調節技術によって、SNRPN領域のプロモーターで始まる伸長反応を抑制することで、Ube3a遺伝子発現回復を試みる。
本年は、2022年6月1日から2023年4月10日まで、産前産後休暇と育児休業を取得していたため、休業期間は研究を中断していた。育児休業が終わり、研究が再開してから、細胞培養と遺伝子導入の実験準備を進めている。
今後は、SH-SY5Y株にdCas9-KRAB-MeCP2ベクターとgRNA発現ベクターをエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、UBE3A-ATS発現低下レベルにより、遺伝子治療に最適なgRNAを選択する。さらに、dCas9-KRAB-MeCP2ベクターと最適なgRNAベクターの配列を搭載した、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
産前産後休暇と育児休業を取得したため、本年度の目標であった、最適なgRNA選択のために、神経芽細胞腫へのCas9ベクターと複数のgRNAベクターの遺伝子導入による、UBE3A-ATS発現低下の解析ができていない。遺伝子治療に最適なgRNAを選択した後、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
神経芽細胞腫を用いて、UBE3A-ATS転写抑制に最適なgRNA配列を確認した後、Cas9配列と選択したgRNA配列を含むウイルスベクターを作製する。作製したウイルスベクターをHEK293T細胞へ遺伝子導入を行い、ウイルス産生細胞を作製する。ウイルス産生細胞から、AAV Extraction solutionを使用して、ウイルス粒子の精製を行う。作製したウイルス粒子は神経芽細胞腫に感染させ、UBE3A-ATS発現低下の確認を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
産前産後休暇と育児休業を取得していたため、研究を中断せざるを得なく、試薬購入と実験ができなかったため。
本年、ウイルス粒子作製に必要な物品を購入して、予定していたウイルスベクターおよびウイルス粒子の作製を行う予定である。
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