| 研究課題/領域番号 |
21K16076
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
大瀧 陽一郎 山形大学, 医学部, 助教 (80732693)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | PlexinB1経路 / Sema4D / 病的心肥大 |
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| 研究実績の概要 |
心筋細胞におけるSEMA4D-PlexinB1経路の機能解明・・・新生仔ラット心筋細胞に対して、SEMA4Dで刺激を行った。ERK1/2のリン酸化は短時間刺激では抑制されたが、長時間刺激ではリン酸化が促進された。しかし、SEMA4D刺激のみでは心肥大の指標であるmyh7のmRNA発現は亢進せず、また心筋細胞肥大は惹起されなかった。以上から、リガンドであるSEMA4Dが心筋細胞肥大に寄与するか不明瞭と考えられた。
一方、PlexinB1はWnt3aで培養心筋細胞を刺激したところ、6時間からタンパク質発現が有意に増加した。培養心筋細胞にいてPlexinB1をsiRNAでknockdownすると、ERK1/2・AKT/GSK3βのリン酸化が抑制された。免疫沈降法を用いて心筋細胞においてPlexinB1とRhoGEFが結合することを同定した。
病的心肥大モデルにおけるPlexinB1の機能解明・・・野生型マウスに大動脈縮窄手術を施行したところ、28日後の心組織においてPlexinB1のmRNA発現が亢進した。また、免疫沈降法をおこなったところ、Sham手術群ではPlexinB1とRhoGEFの結合は認めなかったが、大動脈縮窄手術群ではPlexinB1とRhoGEFが結合した。以上から病的心肥大においてPlexinB1がRhoGEF/Rho経路に関連することが示唆された。心筋組織におけるPlexinB1のリガンドや共受容体を詳細に検討するために、心筋特異的PlexinB1過剰発現マウスを作成する方針とした。現在は、αMHCプロモーターにPlexinB1を組み込んだコンストラクトを作成し、隣接する遺伝子実験施設に心筋特異的PlexinB1過剰発現マウスの作成を依頼中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
新生仔ラット培養心筋細胞に対してWnt3a刺激を行うことで、PlexinB1のタンパク質発現が亢進した。一方で、野生型マウスに大動脈縮窄手術を行ったところ、PlexinB1のmRNA発現が亢進した。免疫染色を行い、PlexinB1が発現する細胞を検討したところ、心筋細胞で増加する傾向を認めた。以上の結果を踏まえて、PlexinB1は病的心肥大において発現が亢進する受容体である可能性が示唆された。PlexinB1の機能を検討するために、培養心筋細胞において、siRNAを用いてノックダウンしたところ、ERK1/2・AKT/GSK3βのリン酸化が抑制された。myh7に関しても抑制する傾向にあり、in vitroでPlexinB1をノックダウンすると心肥大シグナルが抑制されることが示唆された。
病的心肥大を抑制する機序として、RhoGEF/Rho経路を抑制することを想定している。そこで、培養心筋細胞においてPlexinB1がRhoGEFと結合することを免疫沈降法で確認した。さらに、野生型マウスに大動脈縮窄手術を施行した心組織において同様にPlexinB1とRhoGEFが結合することを免疫沈降法で確認した。
遺伝子介入により、PlexinB1が病的心肥大に関与するのを検討するために、心筋特異的PlexinB1過剰発現マウスを作成する方針とした。αMHCプロモーターとHisタグを付加したPlexinB1をコンストラクトに挿入した。同コンストラクトを用いて、隣接する遺伝子実験施設でマウスを作成依頼している段階である。
実験に必要な手技として大動脈縮窄手術やアンギオテンシンをオスモティックポンプで投与する手技に関しては習熟している。
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| 今後の研究の推進方策 |
SEMA4Dの単独投与では、心筋細胞肥大が惹起されなかったため、PlexinB1を中心に検討を行う方針としている。他方、PlewxinB1は病的心肥大において発現が亢進する知見が得られた。そのため、PlexinB1のリガンドを同定することでSEMA-Plexin経路の重要性が示されると考えた。PlexinB1のリガンドを同定するのは難しいが、機能解明も含めてPlexinB1過剰発現マウスを作成する方針とした。現在、PlexinB1にHisタグをつけたコンストラクトを作成し、隣接する遺伝子実験施設に作成依頼をしている段階である。F2が生まれてきたら大動脈縮窄手術を行い、病的心肥大や生存率を比較検討する。また、アンギオテンシン投与により心肥大を誘導し、野生型マウスと比較検討を行う。
他方、SEMA4Dが単独で心筋細胞肥大を誘導できなかったが、Wnt3aと同時刺激を行うことで心筋細胞肥大を増悪する因子として働く可能性がある。そのため、培養心筋細胞において、同時刺激を行い心筋細胞肥大の程度を比較比較検討していく。同時刺激により心筋細胞肥大が増悪した場合には、マクロファージ細胞株であるRaw細胞と共培養を行い、マクロファージ由来のSEMA4Dが、培養心筋細胞肥大を増悪するか追加で検討する。
培養心筋細胞に対して、PlexinB1を過剰発現やノックダウンを行った上で、Wnt3aやアンギオテンシンで刺激し、心筋細胞肥大に与える影響を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
残金は、少額なので、次年度の消耗品購入に使用する予定です。
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