| 研究実績の概要 |
顕性遺伝型栄養障害型表皮水疱症（DDEB）の細胞モデル作成のために、当初、不死化ヒト線維芽細胞を用いる予定であったが、western blotによるVII型コラーゲンタンパクの検出が上手くいかず、不死化ヒト角化細胞であるKer-CTを用いて実験を進めた。CRSIPR-Cas9を用いてCOL7A1のExon73をターゲットにゲノム編集を行い、限界希釈法にてクローニングした。クローニングした細胞をサンガーシーケンスを用いてDNA配列を確認し、複数のクローンが得られた。代表的なクローンとしてclone 61E8では片アレルは正常で、もう片アレルには6塩基の欠失により変性したCOL7A1タンパクを発現すると考えられた。また、clone 62F3ではそれぞれのアレルで3塩基、9塩基の欠失がみられ、両アレルともにナンセンス変異によりタンパク発現が消失すると考えられた。配列からは61E8がDDEB、62F3がRDEB（潜性遺伝型）の栄養障害型表皮水疱症のモデル細胞となることが期待され以後の実験で確認した。
WT, 61E8, 62F3のそれぞれの細胞を用いて蛍光免疫染色を行うと、WT, 61E8では細胞内にCO7A1抗体にて蛍光されるタンパクがみられたが、62F3では蛍光染色されるタンパクはみられなかった。また、western blotではWT, 61E8では290kDa付近にCOL7A1タンパクのバンドが得られたが、62F3では同様のバンドはみられなかった。これらの結果から61E8はDDEB、62F3はRDEBのモデル細胞となることが示唆された。
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