2022 年度実施状況報告書

I型アレルギー反応の決定的セルグリシン：肥満細胞分泌顆粒への輸送機構

研究課題

研究課題/領域番号	21K16311
研究機関	愛知医科大学
研究代表者	塩入達政愛知医科大学, 分子医科学研究所, 助手 (40896891)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2026-03-31
キーワード	セルグリシン / グリコサミノグリカン
研究実績の概要	セルグリシン (Serglycin、以下SRGN) はヘパリン鎖を付加した小型のプロテオグリカンで、肥満細胞の分泌顆粒においてタンパク質分解酵素やヒスタミン等の活性アミンと結合し、これらの分子群を分泌顆粒内に高濃度に蓄積することから、I型アレルギー反応の鍵を握る分子と考えられている。しかし他のプロテオグリカンが細胞外へ恒常的に放出されるのに対し、同分子のみがなぜヘパリンを付加し、分泌顆粒に局在するのかは解明されていない。本研究の目的は、肥満細胞におけるSRGNの分泌顆粒への輸送機構を、他のプロテオグリカン（パールカン）との局在の比較によって明らかにすることである。ライブイメージングによる解析手法を確立するため、ラット好塩基球性白血病細胞株（RBL-2H3）に対してCRISPR Cas9システムを用いてゲノム編集を行いSRGNと蛍光タンパク質mCherryの融合タンパク質を発現する細胞株RBL-SRGN-mCherryを樹立した。この細胞株に対してさらに分泌顆粒マーカーであるニューロペプチドYまたはゴルジ体マーカーであるガラクトース転移酵素と蛍光タンパク質Gamillusの融合タンパク質を発現させ共焦点顕微鏡にて局在を観察した。その結果、SRNGの分泌顆粒での局在は確認されたもののゴルジ体での発現は確認されず、この手法ではSRGN生合成の初期段階から輸送経路を追跡することは困難と判断した。並行して、SRGNの輸送を担う特異的分子を同定する目的でAirID系を導入した。AirIDは近傍タンパク質を非特異的にビオチン化する酵素であり、SRGNとの融合タンパク質を発現することで近傍分子をビオチン化し質量分析により目的タンパク質の近傍分子を網羅的に解析することが可能である。現時点では上記の近接分子の同定には至っていないが他の近接分子同定系を採用する等して同定を試みている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由これまでの研究において実験系には大きな問題はないと考えている。細胞内の分子の蛍光観察が予想以上に困難であったのは、恐らく分子の合成、輸送が恒常的に行われているからと推測している。また近傍分子の道程についてはAirIDの特異性が想定以上に高かったからと考えている。
今後の研究の推進方策	可逆的タンパク質繋留法(RUSH: Retention using selective hooks法)と近傍ビオチン化酵素を組み合わせた手法を開発しSRGNの細胞内輸送経路の解明を進める。RUSHシステムとは、目的分子を小胞体内にと局在させておき、ビオチンの添加で分子の輸送を開始させ、目的分子の輸送過程を経時的に追跡することが可能なライブイメージングを用いた技術である。この技術に近傍ビオチン化酵素を組み合わせることで継時的に目的タンパク質と近接している分子を特定すること可能であると考えている。小胞体、ゴルジ体、分泌顆粒と局在が異なるタイミングでビオチン化された近接分子を質量分析により網羅的に解析していくことで細密な輸送経路を特定する予定である。
次年度使用額が生じた理由	研究計画の変更を行ったため、未使用残額が生じた。次年度の消耗品費として使用する。