| 研究課題/領域番号 |
21K16324
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
中村 朋文 熊本大学, 病院, 診療助手 (00772526)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | HIV-1 / HIV-1 タンパク質 / HIV-1 RNA / NCINIs / HIV-1形態 |
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| 研究実績の概要 |
Non-catalytic site integrase inhibitors（NCINIs）の変異体解析：
NCINIsはINとHIV-RNAの結合を阻害する薬剤である。本研究では、NCINIs耐性アミノ酸変異を有するHIV-1 cloneの解析を行った。Integrase(IN)内のNCINIs耐性アミノ酸変異であるp26変異(A128T,H171Q,K173Q,N254K)は、NCINIsに関連する耐性変異であり、p26変異を有するHIV-1-IN・p26 cloneはHIV-1への感染性が低下していた。共存して認められたNucleocapsid(NC)内の変異であるD48Nは、明らかなNCINIsに対する耐性化を認めておらず、一方でHIV-1-NC・D48N cloneの細胞感染性を軽度上昇させていた。しかし、IN内のp26とNC内のD48Nの変異を両方有するクローンは、HIV-1の感染性および複製能が低下した。それぞれの変異体に関して逆転写効率を確認したところ、NC・D48N変異とIN・p26の変異をもつクローンはその逆転写効率が極端に低下していた。これは、NCとINが協調して逆転写に影響していることを示唆する所見である。
蛍光複合体（SNAP-448-NC 、SNAP-546-IN ）の相分離現象の解析：
HIV-1由来のタンパク質の相分離現象を確認するために蛍光物質（SNAP-Surface 488または546）をHIV-1タンパク質に結合させた複合体に関してE.coliを用いて精製・作成した。野生株に加えて、上述したNCINIs 変異株が相分離現象にどのような影響与えるか？変異体の作成も行った。NCは水溶性の乏しい不安定なタンパク質であり、非常に精製が困難であった。SNAP-INおよびSNAP-NCの野生株と変異株を蛍光顕微鏡を用いて、時間及び空間的な計測および解析を行ったが、沈殿が多く未だ解析が困難である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
我々はNCINIs変異を有するHIV-1 cloneを作成し、TZM-bl assay, MTT assay, P24 assay, real-time PCRを用いることによって、耐性変異によって生じるウイルスの特性をある程度評価することができた。続いて、蛍光複合体が連結した（SNAP-448-NC 、SNAP-546-IN ）を作成することによって、野生株と比較して、変異を有するHIV-1タンパク質の特性（folding、安定性、水溶性など）がどのように変化するか？を分析・評価を進めていた。しかし、NCは非常に不安定な蛋白質で反応bufferに添加するだけで沈殿が生じてしまう。可溶性タンパクを付加することでこの問題をクリアすることを目指しているが、やや構造が大きくなるために、実際の挙動と異なる可能性も否定できない状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々はNCINIs変異を有するHIV-1 cloneの特性を調べた。これらの既知の実験データと今後の実験で得られるHIV-1 RNAの情報を追加し、HIV-1タンパク質とRNAの相互作用およびウイルス形態（構造形成）に関する知見を集積して行く予定である。実験で認められた変異を有するHIV-1 cloneの感染性および複製能の低下が、HIV-1タンパク質の構造学的な異常に伴う影響なのか？機能的な異常に伴う影響なのか？深く理解するために、今後は、simulationモデルや、電子顕微鏡(TEM)を用いて、HIV-1の詳細な形態（構造変化）を評価することが非常に重要であると考えられる。さらに、HIV-1 RNAの構造を予測するために次世代シークエンサー等を用いた画期的な方法：functional analysis of RNA structure-sequencing (FARS-seq)も検討しながら、新たな知見を集積していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、タンパク質作成等の準備は進んだが、評価実験を中心にルミパルスカートリッジによるP24の測定、HIV-1形態評価のための電子顕微鏡撮影など、の比較的高額な実験が行われなかった。また、COVID-19による学会のハイブリット形式の開催で旅費等の使用がなかったため、次年度使用額が生じる結果となった。
次年度はさらに実験内容の充実（電子顕微鏡撮影・次世代シークエンサーによる解析）を図り、できる限り現地での学会への参加を検討している。
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