| 研究課題/領域番号 |
21K16514
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
土肥 良一郎 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (00817786)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 肺再生 / 細胞治療 / ダイレクトリプログラミング / 肺線維芽細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、ケミカルダイレクトリプログラミングによって肺胞上皮細胞へ部分的に誘導されつつあるヒト肺由来線維芽細胞を、脱細胞化によって得られた生理的な3次元の臓器特異的な空間的鋳型にはめることで、肺胞上皮細胞への誘導を完了させる手法を開発し、将来的に手術検体から肺の再生治療を実現することである。
実験の第1段階は、ヒト肺由来線維芽細胞を用いた低分子化合物による直接リプログラミング法の開発することである。令和3年度は、実験の第1段階として、肺常在の線維芽細胞の表現型の確認と本研究で細胞源とする線維芽細胞の選定の工程を進めた。肺組織由来の線維芽細胞は肺全体の30-40％を構成するとされ、線維化に関与する筋線維芽細胞や、サーファクタントに含まれる脂肪を供給する脂肪線維芽細胞などの表現型が存在する。しかし、後者はヒトにおいても同様に脂肪滴を有するかは議論が多く、また常在肺線維芽細胞については定義がまだ曖昧な部分が多く、同じ表現型でも複数の同定法が報告されているのが事実であったため、本研究で用いる肺常在の線維芽細胞源の免疫表現型とその同定法の決定を慎重に進める必要があった。そのため、当初はヒト検体から採取した線維芽細胞で実験を開始する予定であったが、使用する線維芽細胞のマーカー決定のためにマウス実験を併施する必要があった。PDGFRα-GFPマウスの肺組織から、PDGFRα陽性かつ、αSMAやCD249などの表現型に比較的得的なマーカーで細胞を単離してくる方針とし、現在マウスの実験を進めている状況である。
実験の第2段階として、リプログラミングした線維芽細胞と肺胞上皮細胞の共培養によるin vivoを想定した足場への生着率改善を予定している。令和3年度は、第1段階の実験と並行して、オルガノイドの培養法による2型肺胞上皮細胞の培養・増殖法を習熟した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで細胞の定義が曖昧であった肺常在の線維芽細胞について、ここ数年で線維化や再生の目的とした研究開発が熱い研究領域となり、表現型ごとに複数の同定法が存在することとなった。本研究の目的である肺手術検体から採取した線維芽細胞を用いたダイレクトリプログラミングによる肺再生医療技術の開発を考えると、どの表現型の線維芽細胞を用いるかは非常に重要な出発点となる。複数の表現型から細胞再生へ適する細胞を選定しその同定法を決定するために、マウス実験を併施する方針へ変更した。そのために、当初の実験計画よりも実験進捗が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
肺常在の線維芽細胞の表現型を抽出するために、遺伝子組み換えマウスを使用する必要がある。具体的にはPDGFRα-GFPマウスを用いて、PDGFRα陽性細胞のうち、αSMA陽性の筋繊維芽細胞と、CD249陽性の脂肪繊維芽細胞の両方を、抽出する。表現型を維持しながら、低分子化合物を加えて、リプログラミング因子を同定していく。
さらに令和4年度は並行して、リプログラミングした線維芽細胞を生体内へ生着し成熟化させる段階の基礎となる工程も研究を進める。生体内を模倣した3次元鋳型空間において2型肺胞上皮細胞とリプログラミングした肺常在線維芽細胞との共培養によって、リプログラミング細胞の2型肺胞上皮細胞への分化誘導を想定している。これがうまく行かない場合は、同細胞らの共培養によるオルガノイド内における、分化誘導法の開発へ切り替える可能性がある。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の予定よりもリプログラミング実験の開始が遅れており、当初予定していた低分子化合物の購入を見送ったため、次年度使用額として1,438,940円が生じた。翌年度において、実験計画の変更に伴い必要となった遺伝子組み換えマウスを購入するための費用、飼育費が必要となる。また、当初の実験計画にある、マウスやヒト試料からの細胞単離、細胞培養、組織培養、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入、低分子化合物によるダイレクトリプログラミング、脱細胞化細胞外基質の抽出、マイクロアレイによる遺伝子発現解析、分化マーカーの発現解析、転写因子解析、蛍光顕微鏡用による解析、などに必要な試薬・プラスチック用品を購入する。また、2型肺胞上皮細胞の表現型を維持するためのオルガノイド培養法を追加したことにより、各種の培養基材や試薬、プラスチック用品が必要となる。さらに、研究成果の発表のための旅費や論文投稿費などに使用する予定である。
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