| 研究課題/領域番号 |
21K16520
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| 研究機関 | 大阪公立大学 |
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研究代表者 |
宮本 光 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (20803092)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ブレオマイシン / LPS / マクロファージ |
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| 研究実績の概要 |
7周齢の雄性Wistar ratにブレオマイシン（3mg/kg）を気管内投与、１週間後にLPS（0.15mg/kg）を気管内投与する。LPS投与48時間後に、麻酔下で採血し、血液ガス測定、肺胞マクロファージ採取、肺組織を遺伝子、タンパク発現用に液体窒素で凍結保存、組織学的評価用にホルマリン固定する。本モデルに新規化合物を投与し介入研究を行った。CXCL13mRNAの発現量はLPS気管内投与のみでは24時間後に正常群に比較し4倍に増加するが48時間後には低下する。一方、ブレオマイシンとLPSを気管内投与すると正常群に比較し8倍に上昇し、さらに24〜72時間後にかけて持続することが分かった。また、肺組織中のCCR5遺伝子とIL-10遺伝子の発現をDNA arrayで検証した。CCR5遺伝子とIL-10遺伝子の発現はブレオマイシンとLPS投与群で著明に上昇することが分かった。本モデルに試験化合物を投与し介入研究を行ったが、組織像、血液ガス、各種炎症メディエータに有意な変化は認められなかった。その理由として、試験化合物の投与期間が短く、有効に作用していない可能性が示唆された。そこで7週齢のWistar RatにBLM (3 mg/kg)を気管内投与し、線維化が確立した14日目から低容量のLPS(0.15mg/kg) を3日毎に3回気管内投与し、BLM投与から28日目に犠牲死させるモデルを作成した。BLM投与10日目より試験化合物を開始し、BLM投与から28日目に犠牲死させた(Figure 6)。BLMとLPSによる線維化は試験化合物投与により組織学的に有意に抑制された。さらにcollagen1A1 mRNAの発現もSACによる有意な抑制が認められた。そして、BAL中のマクロファージ数はBLMとLPS投与により増加するが、試験化合物投与により有意に低下することがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マクロファージ の分極をBALFのFACSで測定する予定だったが、うまく染色ができず難渋しており、代用案として免疫染色で判定している。
それ以外はおおむね研究計画通り進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
DNA arrayで複数の上皮間葉移行に関連する因子がブレオマイシン＋LPS投与により有意に上昇し、試験化合物の介入により抑制されることが判明している。試験化合物が上皮間葉移行を制御することで、線維化抑制効果を持つ可能性も示唆されている。本モデルを用いて間質性肺炎における２型肺胞上皮細胞の上皮間葉移行を評価する。肺組織のEカドヘリンとビメンチンをwestern blottingで評価。2型肺胞上皮細胞の指標をSPDとし、Eカドヘリンとビメンチンの２重免疫染色を行い、２型肺胞上皮細胞の上皮間葉移行を評価。新規化合物介入モデルで上皮間葉移行が抑制できているか評価する。
また、肺胞マクロファージ細胞株NR8383を用いて、INFγ刺激によりM1分極化、IL-4, IL-13刺激によりM2分極化を行い、分極できているかを細胞を回収しwestern blottingで評価し、良好に分極できていることを確認しており、さらに試験化合物を添加し、分極に対する影響を評価している。
気管支肺胞洗浄液中のマクロファージの分極をフローサイトメトリーで評価。試験化合物が分極動態に及ぼす作用を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID19の影響により旅費の支出が減少したため。次年度に物品費として使用予定。
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